電針足三里穴對腸易激綜合征大鼠平滑肌收縮蛋白vimentin的影響

劉嬌萍，楊大業，冉國平，劉嘉穎，李?佳*

（1.湖北中醫藥大學基礎醫學院/華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院中西醫結合腫瘤科，430051；2.湖北中醫藥大學針灸骨傷學院/針灸治未病湖北省協同創新中心，武漢?430061）

腸易激綜合征（Ⅰrritable Bowel Syndrome，ⅠBS）是一種感覺動力失調，以對機械性或化學性刺激的高敏感性（即高反應性或易激性）為特征的慢性腸道功能紊亂性疾病，因其發病率高、治療困難、嚴重影響患者生存質量而被逐漸重視[1]。目前研究認為，腸易激綜合征主要表現在[2]：胃腸功能紊亂、腸道高敏感性、神經遞質失衡。針灸防治功能性胃腸疾病有良好的療效，特別是針灸對胃腸動力的調整作用更是研究的熱點之一[3]。近年來的研究逐漸證明，平滑肌肌動蛋白聚合和解聚、細胞骨架波形蛋白（vimentin）的重組與平滑肌細胞收縮動力學過程關系密切，并且研究發現，

vimentin可以調控炎性機制。足三里乃胃之下合穴，亦是足陽明胃經的合穴，乃治療脾胃疾病的要穴，臨床常用之治療胃腸疾病。基于此，我們以平滑肌細胞骨架蛋白vimentin為切入點，以腸易激綜合征模型大鼠為研究對象，探討針刺對胃腸道平滑肌收縮動力以及炎性損傷的影響，為“肚腹三里留”的科學內涵提供實驗依據，進一步揭示和豐富經穴-臟腑相關性。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 三月齡SPF級雌性SD大鼠80只，適應性喂養1周后，隨機分為4組，正常組、模型組、穴位組、非穴位組，每組各20只。動物喂養在湖北中醫藥大學實驗動物中心完成，生產合格證號：SCXK（鄂）2004-0007，環境溫度21～25 ℃，濕度40%～60%。光照時間每日12 h，大鼠可自由取食飲水。

1.2 主要儀器、器材和試劑 BⅠO-RAD化學發光成像系統、XMTD-204恒溫水箱、Milli-Q Direct超純水機、ⅠMS-20全自動雪花制冰機、Powerpac Tm HC電泳儀、Trans-Blot SD Cell轉膜儀、vimentin和GAPDH抗體、G6805-Ⅱ型電針治療儀、0.30 mm×13 mm毫針。

1.3 模型制備 單一方法建立的模型常有局限性，兩種或以上方法聯合復制模型符合發病機制與臨床表現。所以我們以高乳糖飼料喂養與束縛應激相結合的方法制備ⅠBS-D大鼠模型，參照文獻方法[5]加工高乳糖飼料，略作改進進行束縛應激。采用捆綁器每天捆綁大鼠，固定于高鐵架上并傾斜60°放置，使大鼠雙后肢完全制動，1 h后解除束縛，造模共14 d，此造模方法采用相對溫和的應激刺激結合外周致敏法同時使用，大大提高了造模的成功率。正常組常規喂養，束縛應激同模型組，其余各組于造模的同時給予相應的處理。

1.4 干預方法 參照中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“實驗動物針灸穴位圖譜，穴位組選取雙側后三里穴，即實驗大鼠的足三里穴。用0.30 mm×13 mm華佗牌毫針直刺，接G6805-Ⅱ型電針治療儀，連續波，頻率120次/min，強度1 mA，以大鼠雙下肢輕微抖動為宜，留針15 min，1次/d，共14 d。非穴位組選取足三里穴外側5 mm區域作為針刺點，干預方法同電針組。

1.5 指標檢測 1）結腸蠕動波測定：依據相關報告[6]進行測定，1%戊巴比妥鈉尾靜脈注射麻醉大鼠，將自制的結直腸擴張刺激球囊插入大鼠肛門內，記錄單位時間（30 min）內的結腸蠕動波個數。2）小腸黏膜組織炎性因子檢測：剖開腹腔，摘取小腸，縱向剪開，0 ℃生理鹽水清潔沖洗，刮取黏膜組織，- 70 ℃低溫冰箱儲存備用。酶聯免疫吸附法（ELⅠSA）定量檢測目的蛋白含量，檢測指標包括ⅠL-1β、ⅠL-10。3）相關蛋白檢測：蛋白免疫印跡法檢測指標包括vimentin和內參GAPDH。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計量數據以均數±標準差（x±s）表示，對于正態分布數據采用方差分析和t檢驗，非正態分布數據采用Mann-Whitney U檢驗，率的顯著性比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 針刺對各組大鼠腸蠕動波的影響 見圖1。

圖1 各組大鼠30 min腸蠕動波計數總量注：NC：正常；Model：模型；RA：穴位；SA：非穴位。各組30 min大鼠腸蠕動波計數總量比較，模型組與非穴位組大鼠蠕動波次數明顯高于正常組（*P＜0.05），而穴位組與模型組和非穴位組比較，蠕動波減少，差異具有統計學意義（# P＜0.05）。

2.2 針刺對腸易激綜合征結腸黏膜組織炎性因子的影響 見圖2。

圖2 各組大鼠結腸黏膜ⅠL-1β和ⅠL-10的含量注：模型組大鼠結腸ⅠL-1β較正常組高，而 ⅠL-10 較正常組低，相比具有顯著性差異（* P＜0.05）；經電針足三里穴治療后，與模型組、非穴位組相比，結腸黏膜組織中ⅠL-1β降低，ⅠL-10增加，差異具有統計學意義（# P＜0.05）。

2.3 針刺足三里穴對腸易激綜合征結腸組織中vmentin的表達 見圖3。

圖3 各組大鼠結腸組織中vimentin的表達注：針刺足三里穴促進ⅠBS結腸組織中vimentin的表達，與模型組、非穴位組相比，差異具有統計學意義（# P＜0.05），而非穴位組對vimentin沒有影響。

3 討論

中醫學無腸易激綜合征之名，根據其反復腹瀉或便秘，或腹瀉和便秘交替等主癥，散見于中醫學“腹痛”“泄瀉”“下利”“饗泄”“便秘”“滯下”等范疇的文獻中。國家標準《中國臨床診療術語》明確腸易激綜合征病名為“腸郁”。《素問·陰陽應象大論》：清氣在下，則生饗泄，濁氣在上，則生?脹。腹瀉型腸易激綜合征多為脾虛氣滯，運化失職，肝郁氣滯，津液無制而發泄瀉[7]。治療上當宜健脾補虛，行氣。氣得行則大便自調，脾氣旺則津液自行，則泄瀉得解。而且脾虛泄瀉臨床常見，且反復發作，纏綿難愈。從本虛標實論治，重補虛行氣。基于此，我們選取調節胃腸功能的足三里穴，固護后天正氣，調節胃腸功能。

排便習慣及大便性狀的改變是腸易激綜合征的主癥，而胃腸動力學異常和炎性損傷一直是腸易激綜合征病理生理研究的重點。雖然功能障礙的表現呈顯著的廣泛性，甚至可能涉及整個胃腸道，但結腸本身的運動功能紊亂仍然是腸易激綜合征的一個重要特征。因此，結腸功能的紊亂可作為研究腸易激綜合征的切入點。胃腸道疾病發病機制中，消化道平滑肌細胞收縮異常，細胞表型發生改變，從而引起細胞骨架蛋白一系列的變化。而機體內分化成熟的平滑肌細胞與心肌細胞、骨骼肌細胞不同，具有可塑性，能夠在一定的條件下發生表型轉化，從收縮型平滑肌細胞去分化為合成型平滑肌細胞，進而合成多種細胞因子、介質及細胞外基質等參與炎癥和消化道重建；與此相應，平滑肌細胞由生理狀態下的“收縮型”轉化為“合成型”，一些分化標志物表達明顯下調甚至消失，細胞骨架發生重塑，細胞處于去分化狀態，從而喪失收縮功能。由此可見，平滑肌細胞的表型轉化與平滑肌收縮功能和炎癥反應密切相關。而且相關研究表明，早期的炎癥反應可能是平滑肌細胞功能失調的誘因，進而引起腹瀉型為主的腸易激綜合征結腸運動[8]。

參與炎癥反應的粘附分子、趨化因子、細胞因子、炎癥介質等都是NF-κB的靶基因，包括細胞間粘附分子-1、血管細胞粘附分子-1、單核細胞趨化因子-1、白細胞介素 -1（Ⅰnterleukin-1，ⅠL-1）、ⅠL-6、ⅠL-8、ⅠL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-a）等。ⅠL-10是一種抑制性的細胞因子，具有抗炎、免疫抑制活性。ⅠL-1β能增加由巨噬細胞產生的細胞因子如ⅠL-6、ⅠL-10和TNF-a，使中性粒細胞向炎癥部位募集，引起一系列腸道病變，從而導致平滑肌細胞的增生異常。而腸道炎癥時增生異常的平滑肌細胞會導致平滑肌肌層變薄，以致平滑肌運動異常。所以，ⅠL-1β和ⅠL-10不僅能反映炎癥，在一定程度上也反映腸道平滑肌運動功能變化[9]。

中間絲是真核生物細胞的特征性結構，與微管、肌動蛋白微絲組成細胞骨架Vimentin屬于中間絲蛋白的一種，其主要附著在細胞核、內質網及線粒體的旁邊或末端，在支撐及錨固細胞器方面具有重要作用，同時它還能夠維持細胞形狀、細胞質完整性及穩定細胞骨架內的相互作用[10]。平滑肌細胞內F-actin與vimentin均形成絲線狀的微絲，沿同一方向排列有序而又相互交錯的分布于細胞質，在胞質外圍靠近細胞膜處密集排列[11]。近年來的研究逐漸證明，平滑肌肌動蛋白聚合和解聚、細胞骨架波形蛋白vimentin的重組，平滑肌細胞收縮動力學過程與這兩種功能的行使有密不可分的關系[12-14]。而且我們最近的研究也發現[15-16]，平滑肌細胞骨架調節蛋白引起vimentin的磷酸化從而影響該蛋白的重組，進而調節平滑肌細胞收縮[17-18]。但之前對其在炎癥方面的作用研究較少，有實驗表明，波形蛋白能夠影響調控平滑肌細胞炎性小體形成及活性[19]。Vimentin通過不同途徑調控著細胞多種功能，與類風濕關節炎、白內障、丙型肝炎以及腫瘤的發生發展相關[20]。我們實驗證實，針刺可以有效抑制腸易激綜合征模型平滑肌細胞收縮蛋白vimentin的表達，減少炎癥反應，從而對胃腸收縮以及炎癥機制有調節作用。