下肢動脈粥樣硬化斑塊內miRNA-199a-3p對外周血單核細胞的影響

顏雯 鐘文清 許曉雙 胡桂芳 楊美蘭 程佳

動脈粥樣硬化是多因素共同參與的血管壁的慢性炎癥性疾病, 亦是腦卒中、冠心病、周圍血管疾病的病理生理基礎,可對人類健康造成嚴重危害［1］。動脈粥樣硬化的病理顯示,氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)識別、吞噬以及泡沫細胞形成中單核-巨噬細胞的關鍵性和特征性尤為突出, 并對動脈粥樣硬化發揮著重要作用［2］。MV是多種細胞分泌產生的膜囊泡, 表面蛋白具有抗原性, 易被多種受體細胞識別, 因其能轉移來源細胞相關的DNA、蛋白質、miRNA、mRNA的能力而被認為是細胞間通訊、信息傳遞的有效載體［3］。研究表明［4］, MV與動脈粥樣硬化的關系密切, 其攜帶的miRNA可對靶細胞mRNA表達進行調控, 其中miRNA-199a-3p與單核細胞的炎癥反應相關。本次研究通過對下肢動脈粥樣硬化斑塊內miRNA-199a-3p的檢測, 并探討其對外周血單核細胞的影響, 具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月～2017年6月在本院就診的下肢動脈粥樣硬化閉塞癥患者(實驗組)和健康體檢者(對照組), 各60例, 取外周血標本。實驗組患者的入選標準：術前影像學檢查［下肢血管彩超或CT血管成像(CTA)］確診下肢動脈有動脈粥樣硬化斑塊并血管狹窄的患者；排除標準：合并嚴重肝腎功能不全者、惡性腫瘤及孕婦患者。實驗組男36例, 女24例；年齡40～78歲, 平均年齡(66.9±5.2)歲。對照組男34例, 女 26例；年齡40～80歲, 平均年齡(67.2±4.8)歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05), 具有可比性。新鮮血管組織標本取自1例在本院就診的下肢動脈粥樣硬化閉塞癥患者的截肢遠端血管, 以其截肢近端血管作為對照。所有患者均自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-199a-3p表達水平檢測 ①血管組織：取新鮮血管組織標本, 分別提取總RNA, 按照試劑盒說明書采用莖環引物的SYBR Green I實時熒光定量PCR方法檢測miRNA-199a-3p水平。②MV：磷酸鹽緩沖液(PBS)以1∶7的比例加入外周血中進行稀釋, 100000 r/min離心, 2 h, 棄上清液, 沉淀為抽提的MV, PBS懸浮, -80℃保存, 以上述同樣方法進行miR-199a-3p檢測。③外周血單核細胞：6%右旋糖酐溶液加入新鮮外周血, 靜置60 min, 上層液置入其他試管 , 加 入 Hank’s液 (無 Mg2+、Ca2+), 混勻 , 2000 r/min 離心, 10 min, 棄上清液, 洗滌2次；以CD68為單核細胞標志物, 分選并留取單核細胞, 以同樣方法檢測miR-199a-3p表達水平。

1.2.2 單核細胞培養及轉染 復蘇取自液氮罐中的人單核細胞T THP-1凍存管, 采用DMEM培養基(含10%胎牛血清)重懸, 并在細胞培養箱中進行培養, 5% CO2、溫度37℃,離心后傳代或換液, 維持細胞“單個、亮、圓”的懸浮狀態。細胞對數生長期, 分設miRNA-199a-3p inhibitor組、miRNA-199a-3p mimics組、空白對照組, 各組設復孔6個,轉染 miRNA-199a-3p inhibitor、miRNA-199a-3p mimics、FuGENE, 靜置15 min, 置入細胞培養液中培養, 5% CO2、37℃, 3 d后提取RNA濃度及質量。采用超微量分光光度儀對提取的RNA 濃度及質量進行檢測, miR-199a-3p表達水平經實時熒光定量PCR檢測。

1.2.3 趨化因子檢測 各組單核細胞提取總RNA, 逆轉錄為cDNA, 采用PCR檢測MCP-1、RANTES、Fractalkine。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差表示, 采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。p＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-199a-3p表達水平

2.1.1 血管組織內miRNA-199a-3p表達水平 動脈粥樣硬化斑塊內miRNA-199a-3p表達水平(8.49±3.05)高于正常組織的(3.64±1.20), 差異有統計學意義(p＜0.05)。

2.1.2 外周血單核細胞、MV內miRNA-199a-3p表達水平實驗組外周血單核細胞、MV中的miRNA-199a-3p表達水平高于對照組, 差異有統計學意義(p＜0.05)。見表1。

2.1.3 外周血單核細胞各組miRNA-199a-3p 表達水平miRNA-199a-3p inhibitor組外周血單核細胞中的miRNA-199a-3p表達水平低于空白對照組, miRNA-199a-3p mimics組外周血單核細胞中的miRNA-199a-3p表達水平高于空白對照組, 差異有統計學意義(p＜0.05)。見表2。

2.2 單核細胞各組Fractalkine、RANTES、MCP-1的mRNA表達水平 檢測Fractalkine、RANTES、MCP-1的mRNA表達水平, miRNA-199a-3p inhibitor組高于空白對照組, miRNA-199a-3p mimics組低于空白對照組, 差異有統計學意義(p＜0.05)。見圖 1。

表1 實驗組和對照組外周血單核細胞、MV內miRNA-199a-3p表達水平比較

表1 實驗組和對照組外周血單核細胞、MV內miRNA-199a-3p表達水平比較

注：與對照組比較, ap＜0.05

組別 例數 單核細胞 MV實驗組 60 0.89±0.11a 6.29±1.22a對照組 60 0.34±0.09 3.06±0.60

表2 外周血單核細胞各組 miRNA-199a-3p 表達水平比較( x-±s)

圖1 外周血單核細胞各組Fractalkine、RANTES、MCP-1的mRNA表達水平

3 討論

動脈粥樣硬化是個多細胞多因子參加的血管慢性炎癥過程, 其中單核巨噬細胞的誘導活化后粘附于血管內皮并遷徙至內膜下而轉變為泡沫細胞, 進而釋放大量的促炎因子加重局部的炎癥反應, 是動脈粥樣硬化的病變發展的第一步。miRNA-199a-3p在19號染色體p13.2的DNM2基因16號內含子內, 主要在胃癌、肝癌、膀胱癌等腫瘤細胞中高表達,而近期有研究發現miR-199a-3p可抑制上述炎癥反應, 并減少泡沫細胞的形成, 而且發現部分預后良好的動脈粥樣硬化患者血漿中含miRNA-199a-3p的外泌體濃度偏高, 在動脈粥樣硬化的發生發展中miRNA-199a-3p有著重要影響［5,6］。本研究結果顯示, 動脈粥樣硬化斑塊內miRNA-199a-3p表達水平(8.49±3.05)高于正常組織的(3.64±1.20), 差異有統計學意義(p＜0.05)。實驗組外周血單核細胞、MV中的miRNA-199a-3p表達水平高于對照組, 差異有統計學意義(p＜0.05)。進一步證實動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞表達的miRNA-199a-3p可通過MV形式分泌入外周血, 被單核細胞吞噬并產生影響。此外, 由于趨化因子RANTES、Fractalkine、MCP-1與泡沫細胞轉化和動脈粥樣硬化斑塊形成密切相關［7,8］, Fractalkine是CX3C家族趨化因子, 與受體CX3CR1結合, 在動脈粥樣硬化中具促炎作用；MCP-1對平滑肌細胞增殖具有趨化和促進作用；RANTES與CCR5結合作用于T細胞、嗜酸粒細胞及單核細胞上, 可促進動脈粥樣硬化斑塊形成［9,10］。本研究發現, 外周血單核細胞經miRNA-199a-3p inhibitor和miRNA-199a-3p mimics成功轉染后, miRNA-199a-3p表達水平分別上調、抑制, 同時, miRNA-199a-3p對外周血單核細胞內的Fractalkine、RANTES、MCP-1表達具有抑制作用。因此, 推測miRNA-199a-3p能夠抑制上述動脈粥樣硬化過程。

總之, 下肢動脈粥樣硬化斑塊內miRNA-199a-3p水平高表達, 其以MV形式分泌至外周血中, 對單核細胞中的趨化因子表達具有抑制作用, 是動脈粥樣硬化的保護因素。