復合酶法優化地黃多糖的提取工藝研究

王潤珍 利楚云 黃小龍（通訊作者）

（1廣東省中醫院藥劑科 廣東 廣州 510030）

（2廣州采芝林藥業有限公司 廣東 廣州 510145）

熟地黃（Radix Rehmanniae Preparata）為中藥中常用的補血藥，為玄參科植物地黃的新鮮或干燥塊莖經加工炮制而成[1]。生地黃具有清熱涼血，養陰生津，潤腸通便的功效，而熟地黃功效偏于滋補，具有補血滋陰、益精填髓的作用[2]。臨床上常用的補血基礎方四物湯，就是以熟地黃作為君藥。熟地黃多糖是熟地黃中特有的活性成分之一，藥理研究表明，熟地黃多糖有增強免疫力、補血、抗突變、抗腫瘤、抗氧化等生理功能[3]。近年來，有關熟地黃多糖的提取工藝[4-9]已有報道，但是關于復合酶法提取熟地黃多糖的提取工藝鮮見報道，復合酶法具有能耗低、操作簡單、易實現產業化、條件溫和、提取效率高、環境友好等特點，在天然產物的提取中越來越受到重視。因此，本研究通過單因素和L9（34）正交實驗設計，以地黃多糖含量為考察指標，以酶解溫度、酶濃度、酶解時間及酶解pH對多糖得率的影響為試驗因素，優選地黃多糖的提取工藝，為地黃多糖的進一步深入研究提供依據。

1.材料與方法

1.1 試驗材料

DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；SB-3200DTD超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）；UV-1800紫外可見光分光光度計（日本島津公司）；BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）；DGH80-B 恒溫干燥箱（北京中西遠大科技有限公司）。

地黃購買自北京同仁堂，產地為河南焦作；實驗中所用蒸餾水均為市售屈臣氏蒸餾水；葡萄糖（天津市凱通化學試劑有限公司，分析純）；苯酚、濃硫酸（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；中性蛋白酶（酶活力≥100U/mg）、纖維素酶（酶活力≥400U/mg），（大連美侖生物技術有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 精密稱量葡萄糖對照品20mg置于100mL容量瓶中，溶解并稀釋至刻度，混勻后即得0.2mg/mL的葡萄糖標準品儲備液。精密吸取適量葡萄糖標準品儲備液，用蒸餾水分別稀釋至0、10、20、40、80、120、160μg/mL，采用苯酚-硫酸法測定多糖濃度，分別取0.2mL溶液于6個干燥比色管中，向各管中分別加入0.5mL5%苯酚、2.5mL濃硫酸，搖勻，室溫下放置20min，以不加標準溶液的相應溶液作空白，在紫外可見分光光度計490nm下測定其吸光度（A）。按照葡萄糖質量濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制線性標準曲線，其回歸方程為：A=0.7023C-1.9664，R=0.9994。測定多糖質量濃度線性范圍是0～160μg/mL。

圖1 葡萄糖線性圖

1.2.2 樣品處理方法 熟地黃藥材在60℃烘箱中干燥至恒質量后粉碎，過60目篩，置于干燥皿中密封保存，準確稱量熟地黃藥材粉末10.0g，加入復合酶，調節pH，水浴加熱。反應結束后，沸水浴10min將酶滅活，抽濾，濾液定容至250mL，作為供試品溶液。按照上述方法測定多糖濃度。

多糖收率（%）=[多糖含量/（1000×地黃藥材粉末質量）]×100

其中多糖濃度單位為μg/mL，地黃藥材粉末質量單位為mg。

1.2.3 單因素實驗設計 采用單因素實驗考查，以纖維素酶：中性蛋白酶=1:1的復合酶，考查酶解溫度（30、35、40、45、50、55、60℃），酶濃度（4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%）、酶解時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h）和酶解pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）對地黃多糖提取效果的影響，選擇合適的提取條件。

1.2.4 正交試驗設計 復合酶法正交試驗以酶解溫度（A）、酶濃度（B）、酶解時間（C）、酶解 pH（D）為試驗因素，每個因素下設計 3 個水平，根據 L9（34）正交表安排試驗，以地黃多糖含量為指標，優選地黃多糖的提取工藝。正交試驗因素水平見表 1。

表1 正交試驗因素水平

2.結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

按照葡萄糖質量濃度（C）為橫坐標，溶液在490nm處的吸光度（A）為縱坐標，繪制線性標準曲線，其回歸方程為：A=0.7023C-1.9664，R=0.9994。測定總糖質量濃度線性范圍是0～ 160μg/mL。

2.2 單因素和正交試驗結果

單因素結果表明，酶解溫度、酶濃度、酶解時間、酶解 pH對于地黃多糖含量均有影響，其中酶解溫度小于50℃時，隨溫度增高，多糖得率增多，溫度大于55℃時，多糖得率下降，說明此時酶活性降低。酶濃度在4.5%以下時，得率屬于上升狀態，而大于4.5%時，復合酶會對地黃多糖進行分解，降低提取效率。酶解時間大于2.0h時，同樣也會使多糖分解。復合酶在偏酸性條件下pH 6.0時活性最好。

由表2試驗結果可知，對地黃多糖的提取效果的影響順序為：酶濃度（B）＞酶解溫度（A）＞酶解時間（C）＞酶解 pH（D），即復合酶濃度對地黃多糖的提取效果影響最大，酶解溫度次之，酶解時間和酶解pH影響較小。以地黃多糖的得率為考察指標，4因素3水平最佳酶解提取工藝條件為：酶解溫度55℃，酶濃度4.5%，酶解時間2.0h，酶解pH 6.0時，其提取效果最佳。

表2 正交實驗結果及分析

2.3 最佳提取工藝的優化及驗證

在此提取工藝條件下，重復三次進行最優提取條件的驗證，地黃多糖含量占原藥材的 7.58%，RSD=1.77%（n=3）。結果表明，篩選的最佳提取條件基本穩定，有較好的重復性。

3.結論

本文通過復合酶法優化提取地黃多糖工藝，以地黃多糖含量為考察指標，以酶解溫度、酶濃度、酶解時間及酶解pH為試驗因素，得到最佳酶解提取工藝條件為：酶解溫度55℃，酶濃度4.5%，酶解時間2.0h，酶解pH 6.0。在此提取工藝條件下，地黃多糖含量占原藥材的7.58%。利用優化后的復合酶法工藝進行地黃多糖提取，具有操作不僅簡便、快速，而且重復性、穩定性良好等優點，適用于地黃多糖的規模化提取，為地黃多糖的進一步深入研究提供依據。