粳恢35成熟胚的再生體系

周志淑，黃桃翠，歐陽杰*

(1.重慶市南川區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心, 重慶 408400； 2.重慶市農(nóng)業(yè)科學院, 重慶 400000)

水稻是人類最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)備受人們關(guān)注。近年來，隨著生物技術(shù)科學的不斷發(fā)展，采用現(xiàn)代生物技術(shù)中的基因工程, 將外源基因?qū)胨?豐富水稻的基因型。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，提高水稻的抗病、抗蟲、抗逆能力和稻米品質(zhì)[1]的研究在國內(nèi)外越來越受到重視，且已取得很多成果[2-3]。

熱粳優(yōu)35是最新育成的首個南方耐熱雜交粳稻品種。2011年在重慶南川、永川、涪陵和梁平開展了試驗與示范，總面積 16.67 hm2。在遭遇罕見高溫干旱情況下，熱粳優(yōu)35表現(xiàn)出產(chǎn)量水平高、耐熱抗旱能力強、高抗稻瘟病、品質(zhì)優(yōu)、機收適應性好等優(yōu)點[4]。能否成功進行水稻遺傳轉(zhuǎn)化，在很大程度上取決于該水稻品種再生體系的建立。為了建立粳恢35水稻再生體系，本研究參考了前人設(shè)計的培養(yǎng)基，并在此基礎(chǔ)上進行改良，對粳恢35成熟胚進行愈傷組織誘導及再生研究，開展本實驗，可為以粳恢35成熟胚為受體進行遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗的供試材料是粳恢35，種子由重慶中一種業(yè)有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 愈傷組織誘導培養(yǎng)基

NMB培養(yǎng)基3種，N6大量+MS微量+MS鐵鹽+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+水解酪蛋白 1.0 g·L-1+瓊脂粉 7.0 g·L-1+2,4-D 1.0/2.0/3.0 mg·L-1。

NMB+維生素B5培養(yǎng)基3種，在3種NMB培養(yǎng)基中加入維生素B55 mg·L-1。

MB培養(yǎng)基3種，MS大量+MS微量+MS鐵鹽+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+水解酪蛋白1.0 g·L-1+瓊脂粉7.0 g·L-1+2,4-D 1.0/2.0/3.0 mg·L-1。

MB+維生素B5培養(yǎng)基3種，在3種MB培養(yǎng)基中加入維生素B55 mg·L-1。

1.2.2 預分化和分化培養(yǎng)基

預分化和分化培養(yǎng)基成分相同，采用 2 種培養(yǎng)基進行比較。一種是MS大量+MS-Fe鹽+MS微量+B5有機+6-BA 2 mg·L-1+NAA 1 mg·L-1+脯氨酸500 mg·L-1+谷氨酰胺500 mg·L-1+水解酪蛋白300 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂粉8.0 g·L-1，另一種是N6大量+MS-Fe鹽+MS微量+B5有機+6-BA 2 mg·L-1+NAA 1 mg·L-1+脯氨酸500 mg·L-1+谷氨酰胺500 mg·L-1+水解酪蛋白300 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂粉8.0 g·L-1。

1.2.3 壯苗培養(yǎng)基

壯苗培養(yǎng)基為1/2 MB培養(yǎng)基：1/2 MS大量+1/2 MS微量+1/2 MS鐵鹽+1/2 B5有機+蔗糖15 g·L-1+瓊脂粉7.0 g·L-1。

1.3 方法

1.3.1 愈傷組織誘導

取曬干的成熟種子，去殼。將種子置于70%酒精中浸泡30 s后轉(zhuǎn)入NaClO溶液(NaClO∶水為1∶2)中浸泡30 min,然后用無菌水沖洗6～9次，浸泡15 min,再用無菌水沖洗2～3次。在超凈臺上，將成熟胚切下，將其接種于愈傷誘導培養(yǎng)基中，放于26 ℃培養(yǎng)箱中[5]，暗培養(yǎng)2周后，將愈傷組織除去胚芽、胚根，進行繼代培養(yǎng)，放于26 ℃培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)。以后每2周繼代1次，共繼代2次。

1.3.2 分化

選取淺黃色、顆粒狀、質(zhì)地較堅硬密實的愈傷組織,用消毒濾紙進行1～4 d的干燥處理，然后接種到預分化培養(yǎng)基上,進行預分化培養(yǎng), 26～28 ℃,暗培養(yǎng)2周；再接種到分化培養(yǎng)基上,進行分化培養(yǎng),26～28 ℃, 每天光照16 h。

1.3.3 生根及移栽

當愈傷組織在分化培養(yǎng)基上產(chǎn)生的綠芽長到2 cm高時，小心地將綠芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，進行生根培養(yǎng)，26 ℃,每天光照16 h,當根長到約3 cm,苗高12～15 cm時將培養(yǎng)瓶移至室外,打開瓶蓋,進行煉苗,煉苗2～3 d后取出小苗,小心洗去根部培養(yǎng)基,移入大田。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織形成及誘導率

粳恢35在不同培養(yǎng)基中的出愈率有差異，表1表明，NMBD2培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導率最高，達到85.1%，且愈傷組織的狀態(tài)很好，顏色淡黃，結(jié)構(gòu)致密。另外，除了NMBD2培養(yǎng)基以外，在2,4-D濃度相同的條件下，加入維生素B5的培養(yǎng)基，要比沒加入維生素B5的培養(yǎng)基誘導率高，說明培養(yǎng)基中2,4-D濃度是控制愈傷誘導率的主要因素，但當2,4-D濃度不是最適濃度時，維生素B5也可提高愈傷誘導率。

2.2 愈傷組織的分化

愈傷組織的含水量直接影響分化率，干燥、堅硬的愈傷組織分化率較高，而含水量比較高、結(jié)構(gòu)松散的愈傷組織一般很難分化。試驗結(jié)果，愈傷組織干燥處理1 d效果較好，綠點出現(xiàn)時間較早。表2表明，2種分化培養(yǎng)基中，NMB培養(yǎng)基分化效果較好，綠苗分化率達到78.6%。

表1 不同培養(yǎng)基對粳恢35成熟胚誘導愈傷組織的影響

表2 不同培養(yǎng)基對粳恢35成熟胚分化率的影響

3 小結(jié)與討論

對水稻愈傷組織誘導和再生影響較大的是基因型的差異，一般粳稻的培養(yǎng)效果較好，但在不同品種間的培養(yǎng)效果差異也很大。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可利用的外植體種類很多，成熟胚、幼胚和花藥愈傷組織等都可以用作轉(zhuǎn)基因外植體，其中成熟胚因取材方便、不受季節(jié)限制，在轉(zhuǎn)基因研究中有著較為廣闊的應用前景。組織培養(yǎng)中2，4-D濃度是形成愈傷組織的必要條件，許多研究表明，單一激素成分培養(yǎng)的效果較差，合理的激素配比是保證組培效果的基礎(chǔ)。關(guān)于2，4-D與其他激素搭配使用的研究很多，結(jié)果不相一致。本實驗與李玉靜等[6]在誘導日本晴愈傷組織時采用2，4-D與6-BA搭配使用，顯著提高了愈傷誘導率的研究成果較為一致。根據(jù)Kumar等[7]的研究，本實驗的培養(yǎng)基中也加入了維生素B5，誘導愈傷的實驗結(jié)果不太理想，可能與誘導材料基因型關(guān)系較大，維生素B5對不同基因型的水稻成熟胚的再生誘導還有待于進一步研究。

干燥處理對愈傷組織的分化起到了促進作用，干燥處理的時間控制在1 d較好，這與劉永巍等[8]的研究成果基本一致，但處理時間不宜過長，時間過長較易被污染，隨著時間加長，分化效果下降，處理1 d較為適宜。