鴨坦布蘇病毒E蛋白的原核表達(dá)

顧玲玲，朱善元，王安平

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

自2010年4月以來，我國大部分養(yǎng)鴨地區(qū)包括浙江、廣東、廣西、江蘇、河北、福建、山東等爆發(fā)了一種以蛋鴨產(chǎn)蛋嚴(yán)重下降為特征的急性傳染病。該病的傳播相當(dāng)迅速，給我國養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大威脅。經(jīng)分離鑒定，該病由一種新病毒引起，該病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，命名為鴨坦布蘇病毒(duck tembusu virus，DTMUV)[1-4]。

鴨坦布蘇病毒粒子的大小為45～50 nm，基因組為單股正鏈RNA，全長約11 kb，只編碼1個(gè)多聚蛋白，即僅含有一個(gè)開放閱讀框(ORF)。此多聚蛋白經(jīng)蛋白酶剪切形成3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、PrM、E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[5-6]。其中，E基因編碼的囊膜蛋白E是病毒最大的結(jié)構(gòu)蛋白和主要的包膜蛋白，在介導(dǎo)病毒與宿主受體蛋白結(jié)合、侵入及病毒與細(xì)胞膜的融合等方面發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。病毒特異性中和抗體位點(diǎn)主要是在E蛋白上，該位點(diǎn)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[7]。此外，E蛋白既含有群特異性抗原表位又含有型特異性抗原表位，還含有與中和抗體反應(yīng)的抗原決定簇[8]。鑒于此，利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)DTMUV的E基因，以期表達(dá)出具有免疫原性的E重組蛋白，為DTMUV E蛋白結(jié)構(gòu)功能研究及基因工程亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和載體

DTMUV奉賢株由中國上海獸醫(yī)研究所惠贈；原核表達(dá)載體pET-30a由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

高保真Pfu酶、T4 DNA連接酶、預(yù)染蛋白質(zhì)Maker、1 kb DNA Maker、限制性核酸內(nèi)切酶SacI、BamH I均購自Thermo公司；RT-PCR試劑盒購自Invitrogen公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自AxyPrep公司；丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、DAB顯色試劑盒及抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Southern Biotech公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參考NCBI GenBank收錄的DTMUV 奉賢株E基因序列，設(shè)計(jì)1對特異性引物，分別在上、下游引物的5′端引入SacI和BamH I酶切位點(diǎn)。引物序列F為5′-TTAGGATCCTTCAGCTGTCTGGGGATG-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，R為5′-TGAGA GCTCGGCATTGACATTTACTGC-3′(下劃線為SacⅠ酶切位點(diǎn))。預(yù)期擴(kuò)增片段大小約1 500 bp。引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 DTMUV的增殖與病毒RNA的提取

取10倍稀釋的鴨坦布蘇原代病毒0.2 mL，經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡SPF雞胚，于37 ℃孵化箱孵化。棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，收獲24 h后死亡胚的尿囊液。按Trizol法抽提尿囊液總RNA，具體操作步驟參照說明書。

1.5 E基因的擴(kuò)增

以提取的總RNA為模板，Oligo dT為引物，利用Invitrogen公司的RT-PCR試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。20 μL反應(yīng)體系為RNA 4 μL、DEPC 7 μL、Oligo dT 1 μL、5×RTase Buffer 4 μL、RNA抑制劑1 μL、dNTP 2 μL、RTase 1 μL。反應(yīng)程序設(shè)定為25 ℃ 10 min，42 ℃ 90 min，70 ℃ 10 min。以擴(kuò)增的cDNA為模板，高保真PCR擴(kuò)增目的E基因。50 μL反應(yīng)體系為DNA 1 μL，10×Buffer 5 μL，上下游引物各2 μL，dNTP 5 μL，高保真Pfu酶1 μL，ddH2O 34 μL。反應(yīng)程序設(shè)定為94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 重組表達(dá)載體pET-E的構(gòu)建

利用AxyPrep凝膠回收試劑盒回收E基因PCR產(chǎn)物，將回收的E基因PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET-30 a分別用SacI和BamH I雙酶切后回收，T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)15 h。隨機(jī)挑取單菌落，接種于含卡那青霉素(50 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。以過夜菌為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR初步鑒定為陽性的菌株提取質(zhì)粒，用SacI和BamH I雙酶切鑒定，鑒定正確的菌株送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測序。

1.7 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

將測序正確的重組質(zhì)粒pET-E及載體質(zhì)粒pET-30a分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，挑取單菌落接種于含卡那青霉素(50 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至含卡那青霉素(50 μg·mL-1)的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600值達(dá) 0.4～1.0之間時(shí)，加入IPTG至終濃度1.0 mmol·L-1，37 ℃誘導(dǎo)3～5 h，離心收集菌體，溶于適量PBS中，超聲波裂解菌體，取裂解后的菌液與5×loading buffer混勻，煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。

1.8 重組蛋白的Western blot鑒定

將誘導(dǎo)樣品pET-E和pET-30a進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，以抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，經(jīng)DAB顯色后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 E基因的擴(kuò)增

將E基因 PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條約1 500 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期目的條帶大小一致。

M為Marker；1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒pET-E的鑒定

將回收的目的基因E與載體pET-30a連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子。SacI和BamHⅠ雙酶切鑒定后產(chǎn)生與預(yù)期條帶大小一致的2條條帶，分別為1 500和5 400 bp(圖2)，表明E基因已成功克隆入載體pET-30a中。

M為Marker；1為pET-E的Sac I和BamH I酶切產(chǎn)物

2.3 SDS-PAGE分析

將測序正確的重組表達(dá)載體pET-E及載體質(zhì)粒pET-30a分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組蛋白獲得較高水平表達(dá)，SDS-PAGE分析結(jié)果(圖3)顯示，在約63 ku處出現(xiàn)一條明顯的特異性蛋白條帶，與預(yù)期的6His-E融和蛋白大小一致，且均以包涵體形式存在。

M為Marker；1為pET-30a誘導(dǎo)菌裂解沉淀；2為pET-E誘導(dǎo)菌裂解沉淀

2.4 Western blot分析

以抗His標(biāo)簽的鼠單抗為一抗對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，在分子質(zhì)量約63 ku處出現(xiàn)了特異性條帶，與預(yù)期條帶大小一致，表明表達(dá)的重組蛋白具備良好的反應(yīng)原性。

M為Marker；1為pET-30a誘導(dǎo)菌裂解沉淀；2為pET-E誘導(dǎo)菌裂解沉淀

3 討論

2010年，鴨坦布蘇病毒病席卷了我國整個(gè)養(yǎng)鴨密集地區(qū)。此后，該病每年均有爆發(fā)，已成為困擾我國養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。該病目前無有效的治療藥物，因此，研制預(yù)防本病的疫苗顯得尤其重要。

E蛋白是構(gòu)成鴨坦布蘇病毒的主要毒力抗原，具有較好的免疫原性，機(jī)體產(chǎn)生的病毒中和抗體主要就是由E蛋白誘導(dǎo)生成的[7]。對黃病毒屬多數(shù)成員的研究表明，病毒感染的宿主范圍、毒力大小、保護(hù)性免疫、膜融合以及組織嗜性等大多與E蛋白有著極其重要的關(guān)系。因此，進(jìn)行E蛋白的克隆表達(dá)，對E蛋白結(jié)構(gòu)功能研究及基因工程亞單位疫苗的研制具有重要意義。

本研究利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出鴨坦布蘇病毒E蛋白完整基因片段，采用pET表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了E蛋白的原核表達(dá)載體。對原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行可溶性分析，結(jié)果表明，表達(dá)的E蛋白主要以包涵體的形式存在于裂解后的菌體沉淀中。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明，表達(dá)的E蛋白能夠與抗His標(biāo)簽的鼠單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，且大小與預(yù)期一致，表明其具有較好的反應(yīng)原性。下一步有必要將重組蛋白進(jìn)行純化并免疫小鼠，制備針對重組蛋白的多抗血清，以便進(jìn)一步用于DTMUV E抗原的檢測及功能研究。