家禽定點(diǎn)屠宰場(chǎng)不同屠宰環(huán)節(jié)雞肉表面真菌結(jié)構(gòu)分析

戴寶玲，楊華，王佩佩，戴賢君，夏文銳，肖英平*

(1.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

近年來(lái)，雞肉的需求量日益增長(zhǎng)，2013年我國(guó)雞肉的產(chǎn)量占中國(guó)禽肉產(chǎn)量的70%[1]。是世界消費(fèi)市場(chǎng)上增長(zhǎng)速度最快的優(yōu)質(zhì)肉類。雞肉具有高蛋白質(zhì)、低脂肪、低熱量、低膽固醇等“一高三低”的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)[2]，能夠提供人體生長(zhǎng)發(fā)育所需的各種必需氨基酸、脂肪酸、無(wú)機(jī)鹽和維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]，且肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，價(jià)格便宜，已成為最受廣大消費(fèi)者歡迎的肉類食品之一。雞肉在肉類消費(fèi)中占據(jù)重要位置，人們也逐漸關(guān)注其食用的安全性。對(duì)禽流感的研究發(fā)現(xiàn)，禽類疫病病原的重要集散地是活禽市場(chǎng)[4]。為了防控禽流感的發(fā)生與傳播，保障雞肉的質(zhì)量安全，一些地區(qū)開(kāi)始禁止活禽交易，實(shí)行家禽“集中屠殺，定點(diǎn)屠宰，冷鏈配送，冷鮮上市”管理[5]。一般情況下，細(xì)菌被認(rèn)為是導(dǎo)致肉制品變質(zhì)的主要原因，有關(guān)肉類細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的研究較多，真菌結(jié)構(gòu)的研究鮮有。肉類在保鮮時(shí)環(huán)境更適合真菌的生長(zhǎng)，易于被酵母腐敗影響肉質(zhì)[6]。由于某些屠宰場(chǎng)條件差，加工不規(guī)范，區(qū)域溫度適宜，而雞肉營(yíng)養(yǎng)豐富，難免會(huì)感染微生物，成為其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，導(dǎo)致雞肉產(chǎn)品存在食用安全隱患。雞真菌感染主要包括曲霉菌病、冠癬、鵝口瘡等, 這些真菌在雞上營(yíng)寄生生活, 引起沉重的慢性疾病[7]，給人們的健康帶來(lái)一定的威脅。本研究對(duì)脫毛、凈膛、預(yù)凈、包裝和冷藏環(huán)節(jié)中雞肉真菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，旨在為保障雞肉的食用安全及改善屠宰場(chǎng)的衛(wèi)生水平提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在浙江某家禽定點(diǎn)屠宰場(chǎng)不同的屠宰環(huán)節(jié)，包括脫毛(D)、凈膛(E)、預(yù)凈(Pr)、包裝(Pa)、冷藏(C)，每個(gè)環(huán)節(jié)隨機(jī)抽取5只雞，裝于無(wú)菌袋中，編號(hào)分別為D1～D5，E1～E5，Pr1～Pr5，Pa1～Pa5，C1～C5。在無(wú)菌室中，每個(gè)雞肉樣品加入與1/2只雞等重的無(wú)菌生理鹽水，振蕩1 min，靜置10 min后取20 mL上清液離心。

1.2 儀器

離心機(jī)，生工生物工程(上海)股份有限公司；Illumina測(cè)序儀，美國(guó)Illumina公司；PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)Biometra公司。

1.3 真菌DNA提取及擴(kuò)增

采用ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM(Zymo Research)試劑盒對(duì)雞肉表面真菌DNA 進(jìn)行提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以DNA 為模板，ITS2引物ITS3-2024-F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4-2409-R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)雞肉表面真菌DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行ITS測(cè)序分析。

1.4 高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

應(yīng)用高通量技術(shù)對(duì)定點(diǎn)家禽屠宰場(chǎng)雞肉表面真菌ITS的ITS2區(qū)域進(jìn)行掃描測(cè)序，QIIME軟件(http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)對(duì)獲得的序列進(jìn)行過(guò)濾篩選，獲得高質(zhì)量的DNA序列[8-9]。通過(guò)計(jì)算α-多樣性指數(shù)(ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù))，對(duì)真菌群落的組成、多樣性和測(cè)序深度進(jìn)行表征，基于OTU聚類分析，繪制稀釋性曲線、真菌結(jié)構(gòu)柱狀圖、豐度熱點(diǎn)圖及主坐標(biāo)分析圖，評(píng)估屠宰場(chǎng)各個(gè)環(huán)節(jié)雞肉表面真菌污染狀況。

1.5 統(tǒng)計(jì)

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，對(duì)有顯著性差異的處理進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞肉樣品真菌的測(cè)序概況

根據(jù)聚類分析，共得到4 908個(gè)OTU，α-多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果如表1所示。家禽定點(diǎn)屠宰場(chǎng)5個(gè)環(huán)節(jié)雞肉表面的真菌群落豐富度均無(wú)顯著性差異。

表1 樣品真菌的測(cè)序概況

稀釋曲線是用來(lái)比較不同樣品中測(cè)序后菌群的豐度及深度，從而反應(yīng)測(cè)序的結(jié)果是否合理[10]。雞肉樣品真菌群落稀釋曲線見(jiàn)圖1。由圖可知，樣品曲線趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序的數(shù)據(jù)量能夠展現(xiàn)出樣品中物種的真實(shí)多樣性組成。其中，包裝環(huán)節(jié)雞肉表面真菌群落的平均相對(duì)豐度最高。

圖1 各樣品的稀釋曲線

2.2 不同環(huán)節(jié)雞肉攜帶的真菌結(jié)構(gòu)

根據(jù)雞肉基因組DNA提取、高通量測(cè)序、生物信息學(xué)分析，構(gòu)建微生物群落組分圖(圖2)，在微生物分類門(mén)的水平上得知，雞肉表面主要分布的真菌門(mén)為擔(dān)子菌門(mén)、子囊菌門(mén)、接合菌門(mén)和壺菌門(mén)。優(yōu)勢(shì)類群為比例超過(guò)96%的真菌群落，包括擔(dān)子菌門(mén)和子囊菌門(mén)，且5個(gè)環(huán)節(jié)雞肉表面攜帶的擔(dān)子菌門(mén)較豐富，平均相對(duì)豐度范圍為69.1%～82.7%。

圖2 各樣品表面真菌群落組分的豐度(門(mén)水平)

熱圖[11]可將高低豐度的物種分塊聚集，通過(guò)顏色的深淺及相似程度來(lái)反映多個(gè)樣品在屬水平上群落組成的相似性和差異性(圖3)。根據(jù)計(jì)算各類真菌在整體中所占比例，屬水平上將真菌群落分為主要類群和優(yōu)勢(shì)類群(表2)。優(yōu)勢(shì)菌屬為毛孢子菌屬，5組中平均相對(duì)豐度分別為63.6%(D)、64.4%(E)、72.8%(Pr)、65.6%(Pa)和71.5%(C)。另外還檢測(cè)出有隱球菌屬,曲霉屬等病原真菌和假絲酵母屬(Candida)等腐敗酵母。

2.3 樣品的聚類與主坐標(biāo)

根據(jù)5組中各個(gè)雞表面樣品OTU計(jì)算樣品間的加權(quán)UniFrac距離，對(duì)25個(gè)樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)。如圖4，PCo1和PCo2分別解釋36.03%和22.87%差異性。結(jié)果表明，來(lái)自同一環(huán)節(jié)雞的樣品幾乎是聚集，脫毛與凈膛和冷藏的樣品有差異。

圖3 各樣品表面真菌群落組分屬水平的豐度

表2 不同環(huán)節(jié)雞肉病原真菌和腐敗酵母相對(duì)豐度 %

圖4 各樣品差異的主坐標(biāo)分析

3 討論

雞肉營(yíng)養(yǎng)豐富，給微生物生長(zhǎng)提供了良好的環(huán)境，在屠宰的不同環(huán)節(jié)會(huì)受到污染，如果污染致病菌，將會(huì)導(dǎo)致食源性疾病[12-13]。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)屠宰場(chǎng)各個(gè)屠宰環(huán)節(jié)雞肉表面病原真菌的檢測(cè)可以看出，高通量測(cè)序技術(shù)克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法中的一些不足，快速獲取了雞肉表面大量真菌菌群的信息。基于高通量測(cè)序平臺(tái)有效序列聚類分析可知，包裝環(huán)節(jié)雞肉表面真菌群落多樣性及豐度最高，可能是因?yàn)榘b間殺菌不徹底，造成真菌大量繁殖，從而污染雞肉，或包裝時(shí)工作人員未清洗消毒，通過(guò)皮膚、頭發(fā)、衣服等將真菌帶入，進(jìn)而污染肉品[2]。

基于不同分類地位的分析顯示，擔(dān)子菌門(mén)是定點(diǎn)屠宰場(chǎng)不同屠宰區(qū)域中雞肉表面的優(yōu)勢(shì)真菌類群，這與前人對(duì)土壤真菌群落研究結(jié)果相似[14-15]。也有學(xué)者研究了人類皮膚真菌發(fā)現(xiàn)，擔(dān)子菌門(mén)豐度較高[16]，說(shuō)明可能是空氣中或人員攜帶的灰塵附著在雞肉表面引起污染。

雞肉表面的優(yōu)勢(shì)真菌屬是毛孢子菌屬，常引起毛孢子菌病[17]，目前認(rèn)為在毛孢子菌屬中可以引起人類疾病的菌種有13種[18-19]。蔣玲玉等[20]研究肺真菌病患者致病菌的構(gòu)成發(fā)現(xiàn)，曲霉屬和隱球菌屬較常見(jiàn)。隱球菌屬中的羅倫隱球酵母和假絲酵母屬中的誕沫假絲酵母在肉制品保藏時(shí)適宜生長(zhǎng)，易引起酵母腐敗。本實(shí)驗(yàn)在雞肉表面檢測(cè)出一定量隱球菌屬真菌，這些真菌不但在雞肉冷凍保鮮后改變其感官品質(zhì)，影響其貨架期[21]，而且使雞肉存在食用安全隱患。

基于高通量測(cè)序技術(shù)的高效、快速特點(diǎn)，利用高通量測(cè)序分析定點(diǎn)屠宰場(chǎng)不同屠宰環(huán)節(jié)雞肉表面的真菌結(jié)構(gòu)可知，雞肉表面優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為擔(dān)子菌門(mén)和子囊菌門(mén)，其中擔(dān)子菌門(mén)最豐富，占69%以上。毛孢子菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，占63.6%～72.8%。此外還有病原真菌隱球菌屬和曲霉屬及腐敗酵母假絲酵母屬等的檢出。