家禽定點屠宰場不同屠宰環節雞肉表面真菌結構分析

戴寶玲，楊華，王佩佩，戴賢君，夏文銳，肖英平*

(1.中國計量大學 生命科學學院，浙江 杭州 310018； 2.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021)

近年來，雞肉的需求量日益增長，2013年我國雞肉的產量占中國禽肉產量的70%[1]。是世界消費市場上增長速度最快的優質肉類。雞肉具有高蛋白質、低脂肪、低熱量、低膽固醇等“一高三低”的營養特點[2]，能夠提供人體生長發育所需的各種必需氨基酸、脂肪酸、無機鹽和維生素等多種營養物質[3]，且肉質細嫩、味道鮮美，價格便宜，已成為最受廣大消費者歡迎的肉類食品之一。雞肉在肉類消費中占據重要位置，人們也逐漸關注其食用的安全性。對禽流感的研究發現，禽類疫病病原的重要集散地是活禽市場[4]。為了防控禽流感的發生與傳播，保障雞肉的質量安全，一些地區開始禁止活禽交易，實行家禽“集中屠殺，定點屠宰，冷鏈配送，冷鮮上市”管理[5]。一般情況下，細菌被認為是導致肉制品變質的主要原因，有關肉類細菌菌群結構的研究較多，真菌結構的研究鮮有。肉類在保鮮時環境更適合真菌的生長，易于被酵母腐敗影響肉質[6]。由于某些屠宰場條件差，加工不規范，區域溫度適宜，而雞肉營養豐富，難免會感染微生物，成為其生長的培養基，導致雞肉產品存在食用安全隱患。雞真菌感染主要包括曲霉菌病、冠癬、鵝口瘡等, 這些真菌在雞上營寄生生活, 引起沉重的慢性疾病[7]，給人們的健康帶來一定的威脅。本研究對脫毛、凈膛、預凈、包裝和冷藏環節中雞肉真菌結構進行研究，旨在為保障雞肉的食用安全及改善屠宰場的衛生水平提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在浙江某家禽定點屠宰場不同的屠宰環節，包括脫毛(D)、凈膛(E)、預凈(Pr)、包裝(Pa)、冷藏(C)，每個環節隨機抽取5只雞，裝于無菌袋中，編號分別為D1～D5，E1～E5，Pr1～Pr5，Pa1～Pa5，C1～C5。在無菌室中，每個雞肉樣品加入與1/2只雞等重的無菌生理鹽水，振蕩1 min，靜置10 min后取20 mL上清液離心。

1.2 儀器

離心機，生工生物工程(上海)股份有限公司；Illumina測序儀，美國Illumina公司；PCR擴增儀，德國Biometra公司。

1.3 真菌DNA提取及擴增

采用ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM(Zymo Research)試劑盒對雞肉表面真菌DNA 進行提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以DNA 為模板，ITS2引物ITS3-2024-F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4-2409-R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對雞肉表面真菌DNA進行PCR 擴增，產物進行ITS測序分析。

1.4 高通量測序及生物信息學分析

應用高通量技術對定點家禽屠宰場雞肉表面真菌ITS的ITS2區域進行掃描測序，QIIME軟件(http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)對獲得的序列進行過濾篩選，獲得高質量的DNA序列[8-9]。通過計算α-多樣性指數(ACE指數、Chao1指數、香農指數和辛普森指數)，對真菌群落的組成、多樣性和測序深度進行表征，基于OTU聚類分析，繪制稀釋性曲線、真菌結構柱狀圖、豐度熱點圖及主坐標分析圖，評估屠宰場各個環節雞肉表面真菌污染狀況。

1.5 統計

采用SPSS統計軟件進行方差分析(ANOVA)，對有顯著性差異的處理進行t檢驗。

2 結果與分析

2.1 雞肉樣品真菌的測序概況

根據聚類分析，共得到4 908個OTU，α-多樣性指數統計的結果如表1所示。家禽定點屠宰場5個環節雞肉表面的真菌群落豐富度均無顯著性差異。

表1 樣品真菌的測序概況

稀釋曲線是用來比較不同樣品中測序后菌群的豐度及深度，從而反應測序的結果是否合理[10]。雞肉樣品真菌群落稀釋曲線見圖1。由圖可知，樣品曲線趨于平緩，說明測序的數據量能夠展現出樣品中物種的真實多樣性組成。其中，包裝環節雞肉表面真菌群落的平均相對豐度最高。

圖1 各樣品的稀釋曲線

2.2 不同環節雞肉攜帶的真菌結構

根據雞肉基因組DNA提取、高通量測序、生物信息學分析，構建微生物群落組分圖(圖2)，在微生物分類門的水平上得知，雞肉表面主要分布的真菌門為擔子菌門、子囊菌門、接合菌門和壺菌門。優勢類群為比例超過96%的真菌群落，包括擔子菌門和子囊菌門，且5個環節雞肉表面攜帶的擔子菌門較豐富，平均相對豐度范圍為69.1%～82.7%。

圖2 各樣品表面真菌群落組分的豐度(門水平)

熱圖[11]可將高低豐度的物種分塊聚集，通過顏色的深淺及相似程度來反映多個樣品在屬水平上群落組成的相似性和差異性(圖3)。根據計算各類真菌在整體中所占比例，屬水平上將真菌群落分為主要類群和優勢類群(表2)。優勢菌屬為毛孢子菌屬，5組中平均相對豐度分別為63.6%(D)、64.4%(E)、72.8%(Pr)、65.6%(Pa)和71.5%(C)。另外還檢測出有隱球菌屬,曲霉屬等病原真菌和假絲酵母屬(Candida)等腐敗酵母。

2.3 樣品的聚類與主坐標

根據5組中各個雞表面樣品OTU計算樣品間的加權UniFrac距離，對25個樣品進行主坐標分析(PCoA)。如圖4，PCo1和PCo2分別解釋36.03%和22.87%差異性。結果表明，來自同一環節雞的樣品幾乎是聚集，脫毛與凈膛和冷藏的樣品有差異。

圖3 各樣品表面真菌群落組分屬水平的豐度

表2 不同環節雞肉病原真菌和腐敗酵母相對豐度 %

圖4 各樣品差異的主坐標分析

3 討論

雞肉營養豐富，給微生物生長提供了良好的環境，在屠宰的不同環節會受到污染，如果污染致病菌，將會導致食源性疾病[12-13]。通過高通量測序技術對屠宰場各個屠宰環節雞肉表面病原真菌的檢測可以看出，高通量測序技術克服了傳統培養方法中的一些不足，快速獲取了雞肉表面大量真菌菌群的信息。基于高通量測序平臺有效序列聚類分析可知，包裝環節雞肉表面真菌群落多樣性及豐度最高，可能是因為包裝間殺菌不徹底，造成真菌大量繁殖，從而污染雞肉，或包裝時工作人員未清洗消毒，通過皮膚、頭發、衣服等將真菌帶入，進而污染肉品[2]。

基于不同分類地位的分析顯示，擔子菌門是定點屠宰場不同屠宰區域中雞肉表面的優勢真菌類群，這與前人對土壤真菌群落研究結果相似[14-15]。也有學者研究了人類皮膚真菌發現，擔子菌門豐度較高[16]，說明可能是空氣中或人員攜帶的灰塵附著在雞肉表面引起污染。

雞肉表面的優勢真菌屬是毛孢子菌屬，常引起毛孢子菌病[17]，目前認為在毛孢子菌屬中可以引起人類疾病的菌種有13種[18-19]。蔣玲玉等[20]研究肺真菌病患者致病菌的構成發現，曲霉屬和隱球菌屬較常見。隱球菌屬中的羅倫隱球酵母和假絲酵母屬中的誕沫假絲酵母在肉制品保藏時適宜生長，易引起酵母腐敗。本實驗在雞肉表面檢測出一定量隱球菌屬真菌，這些真菌不但在雞肉冷凍保鮮后改變其感官品質，影響其貨架期[21]，而且使雞肉存在食用安全隱患。

基于高通量測序技術的高效、快速特點，利用高通量測序分析定點屠宰場不同屠宰環節雞肉表面的真菌結構可知，雞肉表面優勢菌門為擔子菌門和子囊菌門，其中擔子菌門最豐富，占69%以上。毛孢子菌屬為優勢菌屬，占63.6%～72.8%。此外還有病原真菌隱球菌屬和曲霉屬及腐敗酵母假絲酵母屬等的檢出。