Galectin-1在膀胱癌細胞中的表達及其對膀胱癌細胞增殖和遷移能力的影響

吳龍祥，王智，杜丘，寧定龍，李博倫，胡希恒，童時宇

（中南大學湘雅醫院 泌尿外科，湖南省 長沙市 410000）

膀胱癌在我國和世界上均是泌尿生殖細胞最常見的實體腫瘤之一[1]。然而，目前關于膀胱癌細胞生長以及轉移的機制仍未清楚。因此，針對膀胱癌細胞增殖以及轉移的基礎研究極具價值，將有助于臨床上尋找針對膀胱癌診療的新的靶點。半乳糖凝集素1（Galectin-1, Gal-1）是哺乳動物半乳糖凝集素家族的成員之一，已被證實在多種惡性腫瘤中高表達，同時與多種惡性腫瘤的增殖、遷移等生物學活性密切相關[2-4]。然而，目前關于Gal-1在膀胱癌細胞中的研究仍十分缺乏。因此，本研究擬通過熒光實時定量聚合酶鏈鎖反應技術（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）以及免疫印跡技術（western blot,WB）檢測Gal-1在膀胱癌細胞中的表達情況，再通過慢病毒（lentivirus）干擾技術干擾膀胱癌細胞中Gal-1的表達，從而進一步檢測其對膀胱癌細胞增殖以及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1和 T24、RT4、J82三株膀胱癌細胞株系本實驗室保存細胞株，來源于美國組織培養庫（American Tissue Culture Collection, ATCC）。細胞培養于含10%胎牛血清（Gibco公司，澳大利亞）的RPMI 1640培養基和MEM培養基（J82）（Gibco公司，澳大利亞）中，細胞培養在37℃、5% CO2的條件下。

qRT-PCR引物購自英濰捷基(上海)貿易有限公司，引物序列如下：磷酸甘油醛脫氫 酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH）的上游引 物：5'-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3'； 下 游 引 物：5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3'。Gal-1 的 上 游引 物：5'-TCGCCAGCAACCTGAATCTC-3'； 下游引 物：5'-GCACGAAGCTCTTAGCGTCA-3'。TRIzol、逆轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒購 自 Takara公 司。Gal-1、GAPDH、p-AKT、AKT一抗購自CST公司；P38、p-P38、p-JNK以及JNK一抗購自Abcam公司。相應的二抗購自武漢博士德公司，WST-1試劑盒購自武漢博士德生物公司，Transwell板購自Corning公司，慢病毒序列設計以及包裝均購自蘇州吉瑪基因公司。

1.2 儀器與設備

本實驗主要包括以下儀器：CO2細胞培養箱、超凈工作臺、離心機、酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；熒光定量PCR儀（伯樂公司，美國）；電泳儀（伯樂公司，美國）；平板搖床（Heidolph公司，德國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 熒光實時定量聚合酶鏈鎖反應技術（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR） 細胞接種于30 mm培養皿，長至約80%滿后，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）清洗細胞3遍，加入1 ml TRIzol裂解細胞，室溫放置5 min，吸取細胞裂解液，加入200 μl氯仿，混勻，12 000 rpm在4℃離心15 min；離心后吸取上層液體，加入500μl異丙醇，混勻，冰上靜置10 min，12 000 rpm在4℃離心10 min；棄掉上清，70%乙醇溶液清洗沉淀，10 000 rpm在4℃離心5 min，棄上清，空氣干燥，加入適量焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate,DEPC）水溶解沉淀，即為細胞總RNA，利用NanoDrop測量總RNA吸光度，以濃度較高，A（260/280）在1.8-2.0的總RNA為模版進行逆轉錄。逆轉錄體系和反應條件根據試劑盒說明書進行，所得cDNA置4℃備用。qRT-PCR的反應體系為：SYBR Premix Ex Taq（2×），12.5μl；cDNA 模板（用去離子水稀釋10倍），2μl；引物上下游各1μl，加去離子水至總體積為25μl。反應條件為：95℃預變性10 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共44個循環；進入溶解曲線階段。每個樣本設定3個復孔，Gal-1的mRNA的相對表達量通過相對定量分析法2 -△△Ct計算。

1.3.2 免疫印跡技術（western blot, WB） 細胞接種于30 mm培養皿，長至約80%滿后，用PBS清洗細胞3遍，加入1 ml TRIzol裂解細胞，室溫放置5 min，吸取細胞裂解液，12 000 rpm離心30 min。加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性10 min。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電 泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）分離蛋白后轉印至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TIS緩沖鹽水和聚山梨酯20的混合物（trisbuffered saline with Tween 20, TBST）緩沖液洗3次，用相應二抗室溫孵育1 h，增強化學發光（enhanced chemiluminescence, ECL）顯色液顯色。以GAPDH作為內參，采用Image J軟件對圖像進行分析。

1.3.3 慢病毒感染細胞 細胞以5×104/孔的密度接種于12孔板，24 h后每孔加入200μl的敲除Gal-1的慢病毒上清或者對照慢病毒上清并加入終濃度為5μg/ml的聚凝胺。24 h后更換培養基并加入含1.5μg/ml濃度嘌呤霉素的培養基進行篩選。之后每3d換一次培養基，連續篩選14 d后建立Gal-1穩定敲除的細胞株以及對照慢病毒細胞株。應用WB技術檢測Gal-1敲除效率，并用相應細胞株進行后續實驗。

1.3.4 細胞增殖實驗 分別對空白對照組、慢病毒對照組、慢病毒干擾組三組細胞計數并以每孔3×103/孔的密度接種于96孔板中，每組每個時間點設定3個復孔，時間點設定為0 h、24 h、48 h、72 h。利用水溶性四唑鹽-1（water-soluble tetrazolium 1, WST-1）試劑盒，根據說明書測定細胞的增殖能力。利用酶標儀測定吸光度（λ=450 nm和λref=630 nm）。

1.3.5 細胞遷移實驗 細胞消化離心，調整細胞密度為4×105/ml，取0.2 ml接種到transwell小室，并將小室放置入24孔板內，上室內為含有1%胎牛血清的培養基，下室內為含有10%胎牛血清的培養基。24 h后用棉簽擦掉小室內細胞，95%乙醇固定，0.1%結晶紫染色，洗凈風干后顯微鏡下200倍視野下拍照計數。實驗重復3次。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示（±s），組間比較采用Bofferroni t檢驗；P ＜0.05認為具有統計學差異。

2 結果

2.1 膀胱癌細胞中Gal-1在mRNA以及蛋白水平的表達情況

相對于人膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1，Gal-1在T24、RT4、J82三株膀胱癌細胞株中無論是在mRNA水平（見圖1 A）還是蛋白水平（見圖1 B）均明顯高表達。mRNA水平在三種腫瘤細胞株中升高均在10倍以上，統計學差異明顯（P ＜0.05）,蛋白水平與mRNA水平相類似，升高均在2倍以上，統計學差異明顯（P ＜0.05）。同時，無論是mRNA還是蛋白水平，RT4細胞株中Gal-1的表達均是最高的，所以后續實驗選擇了RT4細胞株作為實驗目標。

圖1 Gal-1在細胞株中表達水平的比較（*P ＜0.05）

2.2 干擾Gal-1表達后對膀胱癌細胞增殖能力的影響

如圖2所示，慢病毒干擾組與空白對照組以及慢病毒對照組相比，Gal-1的表達情況顯著降低，統計學差異明顯（P ＜0.05），說明本研究構建的序列可以有效抑制Gal-1的表達。接下來，采用WST-1方法檢測細胞的增殖能力，如圖3所示，空白對照組、慢病毒對照組以及慢病毒干擾組三組細胞的增殖曲線無明顯差別，這說明Gal-1可能并不參與膀胱癌細胞的增殖能力的調控。

圖2 各分組細胞株中Gal-1蛋白表達水平比較（?P ＜0.05）

圖3 各分組細胞株增殖能力比較

2.3 干擾Gal-1表達后對膀胱癌細胞遷移能力的影響

利用transwell遷移實驗檢測三組細胞的遷移能力有無差別。如圖4所示，空白對照組與慢病毒對照組相比，細胞遷移能力無明顯差別；而慢病毒干擾組與另外兩組相比，細胞遷移能力顯著降低，統計學差異明顯（P ＜0.05）,這說明Gal-1參與到膀胱癌細胞遷移能力的調控中，抑制Gal-1的表達可以抑制膀胱癌細胞的遷移能力。

圖4 各分組細胞株遷移能力比較（?P ＜0.05）

2.4 干擾Gal-1表達后AKT、P38、JNK三條通路激活情況的變化

為進一步研究Gal-1如何調控膀胱癌細胞的遷移能力，本研究利用WB技術檢測了AKT、P38、JNK三條與膀胱癌細胞遷移能力密切相關的信號通路的激活情況，如圖5所示，慢病毒干擾組與空白對照組和慢病毒對照組相比，P38以及JNK兩條信號通路的磷酸化水平無明顯區別，而AKT信號通路的磷酸化水平明顯降低，統計學差異明顯（P ＜0.05）。此結果提示Gal-1可能通過改變AKT信號通路的激活水平來調控膀胱癌細胞的遷移能力的。

圖5 各分組細胞株中不同信號通路磷酸化水平對比（*P ＜0.05）

3 討論

膀胱癌是成年人常見的泌尿生殖系統惡性腫瘤之一，其中男性發病比例明顯高于女性，作為一種惡性腫瘤，膀胱癌可直接威脅患者生命[5]。膀胱癌的發病率逐年上升，并且容易進展、復發和轉移，對放化療欠敏感[5-6]。因此，針對膀胱癌發生發展的研究是亟不可待的。膀胱癌的發生和轉移是一個多環節、多因素參與的過程，同時有多個基因、多分子參與調控[7]。化療是轉移性膀胱癌最主要的治療手段，但并不能讓病人有足夠的生存獲益[8]。雖然近年來對膀胱癌的研究取得了一個又一個突破性的結果，但是對其發生的分子機制的研究仍在不斷的探索之中。

Gal-1是第一個被報道的哺乳動物半乳糖凝集素，是一個相對分子質量為14.5 kD的蛋白質，由定位在染色體22q13.1的單基因編碼，具有結構上包含有一段長約135個氨基酸的糖類識別區（carbohydrate-recognition domains, CRD）和對β-半乳糖苷具有特殊親和力的特性[9]。Gal-1通過與受體的結合啟動了多種信號轉導途徑，參與細胞黏附、細胞遷移和免疫反應等多種生物學功能[10]。已有大量研究表明，Gal-1在前列腺癌、結腸癌、肝癌、神經膠質瘤等多種其他惡性腫瘤中高表達，而且這種高表達大多與腫瘤細胞的侵襲及獲得轉移表型密切相關[11-13]，這提示Gal-1可能作為一種原癌基因參與到惡性腫瘤的發生發展中[2]。然而目前關于Gal-1在膀胱癌中的研究十分缺乏，其在膀胱癌中的表達是否有異常以及是否參與到膀胱癌中的發生發展仍有待研究。

本研究通過qRT-PCR以及WB技術證實了Gal-1的表達量不管在基因水平還是蛋白水平在膀胱癌細胞株中較正常人膀胱上皮細胞均明顯升高。這與其他大多數研究者的研究相一致，提示Gal-1可能在膀胱癌的發生發展中起到一定作用。通過慢病毒干擾技術敲除膀胱癌細胞RT4中Gal-1的表達后，利用WST-1技術檢測了細胞的增殖能力。與空白對照組以及慢病毒對照組相比，敲除了Gal-1的細胞的增殖能力并無明顯區別，這提示Gal-1可能并不參與膀胱癌增殖的調控。接著利用transwell遷移實驗檢測敲除了Gal-1的表達后，膀胱癌細胞的遷移能力有無區別。實驗結果表明，敲除了Gal-1的膀胱癌細胞遷移能力與空白對照組以及慢病毒對照組的細胞相比，明顯下降。這提示Gal-1的高表達可能參與到了膀胱癌轉移的過程中。為進一步研究Gal-1如何調控了膀胱癌細胞的遷移能力，本研究檢測了AKT、P38、JNK這3條與膀胱癌細胞遷移能力密切相關的信號通路的激活情況[14-16]。結果表明，敲除了Gal-1的表達后，P38以及JNK兩條信號通路的磷酸化水平沒有明顯改變，而AKT信號通路的磷酸化水平明顯降低。AKT信號通路磷酸化水平與膀胱癌細胞的遷移能力密切相關，這提示Gal-1可能是通過促進了AKT信號通路的磷酸化從而促進了膀胱癌細胞的遷移能力。

綜上所述，筆者發現Gal-1在膀胱癌細胞中表達水平明顯升高。此外，抑制Gal-1的表達可明顯降低膀胱癌細胞的遷移能力。本研究結果初步表明，Gal-1參與了膀胱癌發生發展過程，并在其中扮演促進膀胱癌轉移的角色，Gal-1可能可以作為一個新的針對膀胱癌的治療靶點。然而本研究還存在如下缺陷：①僅僅在細胞水平證實了Gal-1的表達在膀胱癌中表達升高，還需要進一步驗證其在膀胱癌組織中的表達情況；②僅僅證明了敲除了Gal-1后，膀胱癌細胞中的AKT磷酸化水平明顯降低，然而Gal-1如何具體調控AKT磷酸化的過程還有待進一步研究；③對應的實驗研究尚需體內實驗進一步證實在體內是否成立。這些都是未來的研究方向。