生姜轉錄因子基因ZoNAC17的克隆與表達分析

陳美伶，姜玉松

（重慶文理學院特色植物研究院，重慶 402160）

NAC轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子家族，可以與靶基因啟動子的順式作用元件相結合，增強或抑制下游基因的表達，以調控其轉錄效率，在植物生長發育、激素調控、生物與非生物逆境脅迫應答過程中扮演了極其重要的角色[1-2]。1996 年 Souer等[3]從矮牽牛中成功克隆出第一個NAC轉錄因子，之后相繼發現了矮牽牛的NAM基因、擬南芥的ATAF 1/2和CUC2基因[4]，并取其首字母命名為NAC。NAC類轉錄因子具有一個相同的結構特征，即其N端為高度保守區，含約150個氨基酸殘基組成的NAC結構域，該結構域是由A、B、C、D、E五個亞結構域構成[5]，C端為高度變異的轉錄調控區，部分具有跨膜螺旋結構[6]。不同NAC轉錄因子在植物生長發育過程中的功能也不盡相同。研究表明，大豆GmNAC20可以調控生長素信號相關基因的表達，影響植物側根發育[7]；擬南芥ANAC092能誘導與植株衰老相關的基因上調表達，從而加速葉片衰老的進程[8]。此外，NAC轉錄因子還參與了植物激素調控、抗逆境脅迫應答的過程。水稻SNAC2基因的超表達能顯著提升植株對脫落酸（ABA）的敏感度[9]；擬南芥ATAF1、ANAC019和ANAC072/RD26等能誘導植株抗旱、抗鹽、抗枯萎病基因的表達，其超表達能顯著提高植株抗非生物與生物逆境脅迫應答的能力[10-12]；Hu等成功克隆了水稻抗旱耐鹽基因SNAC1，同時利用轉基因技術使轉基因植株具有強抗旱性[13]。目前，NAC轉錄因子的結構與功能在擬南芥、水稻、大豆、玉米等模式植物中的研究已較為深入，然而關于生姜NAC轉錄因子的研究還較為少見。

生姜（Zingiber officinale Roscoe）又名地辛、百辣云，是姜科多年生草本植物姜的新鮮根莖[14]，具有藥食兩用的特點，是我國重要的經濟作物之一。本研究基于生姜轉錄組數據庫，以西南竹根姜（Z.officinale Roscoe cv.Southwest）為材料，利用RT-PCR法克隆ZoNAC17，同時采用數字表達譜分析ZoNAC17在生姜不同組織的表達模式，旨在為進一步探索ZoNAC17轉錄因子調節生姜生長發育、抗逆性應答過程的機理，以及通過基因工程改良作物品質提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為西南竹根姜，于2017年5月播種于重慶文理學院特色植物研究院溫室大棚（土壤濕度25%、溫度25℃、光照強度3 500 Lx、光照12 h）培養。約2個月后，主莖第一次長出側枝時，取其側枝基部，即發育初期的根莖；約3個月后，第一側枝又長出側枝時，取第一側枝的基部，即發育期的根莖；約4個月后，生姜第二側枝又長出側枝時，取第一側枝的基部，即成熟根莖；同時取生姜主莖從下往上第三片葉子，即成熟葉片；取生姜主莖第三片葉子對應的莖部，即成熟地上莖。將上述收集的所有生姜組織置于-80℃冰箱中保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 采用Trizol（Invitrogen，美國）進行生姜根莖總RNA的提取，RNA的完整性經過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后，置于-70℃冰箱中保存。以上述提取的生姜根莖總RNA為模板，利用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Roche，瑞士）合成生姜第一鏈cDNA，于-20℃保存備用。

1.2.2 生姜ZoNAC17基因的克隆 基于生姜轉錄組數據庫，利用DNAMAN軟件中的Premier設計引物（F：5′-GACCTCGATCAACGGTTGA C-3′；R：5′-AATTCAGCGTGCAACTTTTACTG-3′），并交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成引物。以生姜根莖cDNA為模板進行PCR擴增，PCR 反應體系為 25 μL：Taq mix（Biomed，北京）12.5 μL，Primer-F 0.75 μL，Primer-R 0.75 μL，模板 cDNA 0.1 μL，ddH2O 11 μL。擴增條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸3 min，共進行30個循環，最后72℃再延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠，調節電壓至3～5 V/cm（約100 V）進行電泳檢測，觀察結果。

在紫外燈下用刀片切下含目的條帶的瓊脂糖凝膠片，轉移至1.5 mL EP管中，再用Gel Extraction Kit試劑盒（Omega，美國）進行PCR產物回收。將回收的PCR產物純化后，連接pMD18-T載體并轉化大腸桿菌感受態細胞，涂布于含Amp抗生素的平板篩選陽性克隆，提取質粒經酶切鑒定成功后，選取陽性克隆送往蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.2.3 ZoNAC17基因的生物信息學分析 利用DNAMAN 5.0分析ZoNAC17的氨基酸序列，利用ExPASy的ProtParam功能（https：//web.expasy.org/protparam/）預測其分子量、等電點等理化屬性，利用BaCelLo（http：//gpcr.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm）進行亞細胞定位預測，利用SignalP 4.1服務器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）分別對ZoNAC17的信號肽序列和功能結構域進行在線預測。從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載同源性較近的其他物種來源的NAC17序列，同時運用MEGA 5.0軟件進行序列比對，采取鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）進行1 000次Bootstrap計算構建系統進化樹，分析生姜NAC17基因和其他物種NAC17基因的親緣關系。

1.2.4 ZoNAC17基因的表達分析 分別提取生姜的根莖（發育初期、發育期、成熟期）、地上莖（成熟期）、葉片（成熟期）的總RNA，根據Illumina公司的流程構建不同組織的RNA-Seq數據庫，以Bowtie 2.0軟件（http：//bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）將每個RNASeq數據庫中的Reads與ZoNAC17序列映射，映射到ZoNAC17序列的Reads數目可粗略反映不同組織樣本的表達水平，采用FPKM（Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）算法對Reads數目進行標準化處理[15]，得到ZoNAC17在發育初期根莖、發育期根莖、成熟根莖、成熟地上莖、成熟葉片5個處理樣本中的表達圖譜，每個處理均包含3個重復。

2 結果與分析

2.1 ZoNAC17基因克隆及基本理化屬性分析

利用設計合成的特異性引物進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測在約2 000 bp處有一條帶，切膠回收純化該片段，TA克隆后進行測序，測序結果顯示其大小為2 014 bp（圖1）。利用DNAMAN 5.0對測得序列進行分析，結果顯示ZoNAC17基因全長2 014 bp，包括 57 bp 5′-UTR（非編碼區）、142 bp 3′-UTR和1 815 bp ORF（開放閱讀框），編碼604個氨基酸殘基（圖2）。利用ProtParam預測生姜ZoNAC17分子量為67.52 kD，等電點為4.59，蛋白質不穩定系數為47.21，脂肪系數為70.40，其總平均疏水性為-0.478，為不穩定的親水蛋白。采用BaCelLo進行亞細胞定位分析，推測ZoNAC17定位于細胞核。

圖1 生姜ZoNAC17 PCR擴增產物電泳

圖2 生姜ZoNAC17完整ORF及編碼氨基酸序列

2.2 ZoNAC17轉錄因子的結構特征分析

通過在線服務器SignalP 4.1對ZoNAC17氨基酸序列進行信號肽預測分析，結果顯示生姜ZoNAC17不含信號肽（圖3，封二）。用SMART預測其功能結構域，結果顯示該蛋白含有1個低度復雜區LCR（Low complexity region，第1～13位），1個NAM功能結構域（第30～156位），1個跨膜螺旋區（Transmembrane region，第569～591位，圖4，封二）。

圖3 生姜ZoNAC17轉錄因子的信號肽分析

圖4 生姜ZoNAC17的結構域

2.3 ZoNAC17基因的同源性分析

在NCBI中查找并下載同源性較高的其他物種NAC17序列，采用MEGA 5.0軟件將生姜NAC17序列與核桃（Juglans regia）、葡萄（Vitis vinifera）、蘋果（Malus domestica）、西葫蘆（Cucurbita pepo）、大豆（Glycine max）、牽牛（Ipomoea nil）、煙草（Nicotiana tomentosiformis）、小果野蕉（Musa acuminata）、菠蘿（Ananas comosus）、油棕（Elaeis guineensis）、海棗（Phoenix dactylifera）的NAC17序列進行比對，構建系統進化樹。結果（圖5）顯示，生姜NAC17基因與來源于單子葉植物小果野蕉、菠蘿、海棗和油棕的NAC17基因聚成一類，與雙子葉植物核桃、葡萄、蘋果、西葫蘆、大豆、牽牛、煙草的NAC17基因分屬兩個明顯不同的亞族。其中，生姜ZoNAC17和小果野蕉MaNAC17同源性最高，在進化上屬于同一個分支，分子進化最近，親緣關系最為密切。

圖5 生姜ZoNAC17的進化樹分析

2.4 ZoNAC17基因的表達圖譜

利用數字表達譜法分析ZoNAC17基因在生姜不同組織的表達圖譜，結果（圖6）表明ZoNAC17在生姜根莖、地上莖、葉片中均有較強表達，且在成熟組織中表現為地上莖＞葉片＞根莖；在生姜根莖的生長發育過程中，ZoNAC17表達量表現為發育期＞成熟期＞發育初期。

圖6 生姜不同組織ZoNAC17基因的表達圖譜

3 結論與討論

NAC轉錄因子家族廣泛分布于植物基因組中，植物細胞通過多種信號途徑將外界信號傳遞給相關應答的NAC轉錄因子，轉錄因子通過與應答基因啟動子區的順式作用元件結合，激活應答基因表達以調節植物生長發育過程激素調控、脅迫應答以及誘導寄主對病原菌侵染產生抗性等各種生理活動[16]。本研究成功克隆了一個生姜的ZoNAC17基因，發現其N-末端具有一個典型的高度保守的NAM結構域。生姜ZoNAC17的N-末端不具有信號肽，但C端有一個跨膜螺旋區，說明生姜ZoNAC17不是分泌蛋白，而是一個跨膜蛋白，位于細胞和外界的交界處，能夠影響細胞與外界間的信號傳導、營養物質交換等生理過程[17]。相關研究也已證實，跨膜NAC轉錄因子由于具有膜結合的特征，能夠使其對突如其來的外界環境變化迅速作出反應，對植株生長發育、激素調控及逆境應答等相關過程具有重大意義[18]。

NAC17轉錄因子可以明顯分為單子葉植物來源與雙子葉植物來源兩類，同為單子葉植物的生姜屬于姜科而小果野蕉屬于芭蕉科，從分類學角度看二者親緣關系較遠。但本研究結果顯示生姜ZoNAC17與小果野蕉MaNAC17的親緣關系最近，說明Nr數據庫中關于姜科NAC轉錄因子的研究較為少見，本研究克隆到的ZoNAC17的序列豐富了生姜甚至姜科植物的基因庫。NAC基因的表達具有組織特異性，陸地棉GhNAC7[19]在花、子葉和真葉中有較高表達，莖、根、花藥中表達較少。ZoNAC17在生姜不同組織均有較強表達，且在不同成熟組織中的表達量也有所差異，地上莖中表達量最高，葉片次之，根莖最少。在生姜發育過程中，ZoNAC17表達量先增加后逐漸減少，且在發育期表達量最高，這一結果與玉米ZmNACx[20]、擬南芥AtNAC2[21]在各個發育時期與發育器官的表達規律相一致。

綜上所述，本研究成功克隆了ZoNAC17基因，其為親水性較強的跨膜蛋白，亞細胞定位于細胞核，與小果野蕉親緣關系最近，且在生姜不同組織和不同發育時期的表達豐度均存在著顯著差異。本試驗結果為今后進一步探索ZoNAC17在調控生姜生長發育、抗逆境脅迫應答等過程中的功能以及作為候選基因用于改良生姜抗逆性的研究奠定了基礎。