酶解米糠制備低聚糖阿魏酸酯及其抗氧化活性分析

李向菲，劉小瓊，方 芳，王文玉，吳 炫，裴 斐

（南京財經大學食品科學與工程學院/江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心/江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

低聚糖阿魏酸酯（FOs）是低聚糖中不同位置上的糖羥基與阿魏酸羧基酯化形成的一類化合物，這類膳食纖維和酚類物質的酯化物廣泛存在于谷物麩皮中，也是阿魏酸在谷物中存在的主要形式[1-2]。流行病學研究表明，谷物中的酚酸類物質對慢性疾病的預防起著關鍵性作用，長期攝入全谷物能夠有效降低慢性疾病的發病率。這主要是由于FOs在胃和小腸中不被消化、吸收，FOs中低聚糖攜帶阿魏酸至大腸，由腸道菌群分泌的阿魏酸酯酶分解后，阿魏酸被釋放出來，經腸黏膜吸收后持續緩慢發揮其抗氧化功效，提高其生物利用率；而剩余的低聚糖則通過改善腸道菌群結構等功效對機體發揮益生作用[3-5]。2010年，美國食品藥品監督管理局已經以麥麩提取物的名義批準將FOs作為食品配料添加到食品（包括焙烤食品、飲料、乳制品、布丁、谷物制品、加工水果、果汁、加工蔬菜及休閑食品等）中（http：//www.fda.gov/downloads/Food/Ingredients Packaging Labeling/GRAS/Notice Inventory/ucm269544）。

近年來關于FOs生物活性的報道日益增多，而抗氧化活性的研究則是重中之重，正是由于FOs中阿魏酸的存在。已有研究表明，直接喂食玉米糠，麩皮FOs中阿魏酸難以被利用；Zhao等將未進行提取FOs的玉米糠直接喂小鼠10 d，研究發現在尿液中檢測到阿魏酸的量僅占總攝取量的0.4%～0.5%，81%則出現在糞便中，這就表明食用未被加工的玉米糠，其中所含的阿魏酸難以被利用[6]。此外，還有研究表明，游離態的阿魏酸生物利用率極低；Ludovic等分別將游離阿魏酸和與阿拉伯木糖結合的阿魏酸喂食小鼠，研究發現結合態的阿魏酸比游離阿魏酸在小鼠體內的停留時間更久，在尿液中的檢出量更低，且保護組織器官免受氧化損傷的能力更強[7-8]。可見，提取谷物麩皮中FOs具有必要性。

稻谷是我國最主要的糧食作物之一，目前我國水稻產量約占全國糧食總產量的1/2，米糠細胞壁多糖經適度的酸或酶處理可以獲得低聚糖阿魏酸酯[9-10]。考慮到酶的高催化效率、強專一性、污染小及易于控制等優點，本研究首先采用酶水解法研究米糠中FOs提取的適宜條件，在此基礎上，通過不同抗氧化指標的測定，分析米糠FOs的抗氧化活性，以期為米糠的產業化利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

米糠：高郵雙兔米業有限公司；高峰α-淀粉酶（40 000 U/g）、木聚糖酶（6 000 U/g）、中性蛋白酶（60 000 U/g）、糖化酶（10萬U/g）：北京索萊寶科技有限公司；MOPS〔3-（N-嗎啡啉）丙磺酸〕：阿拉丁試劑有限公司；阿魏酸：上海麥克林生化科技有限公司；DPPH：Sigma公司；其他化學試劑均為分析純。

儀器設備：HH-2數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；恒溫磁力攪拌儀，德國Heidolph公司；離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器，金壇市榮華儀器制造有限公司；電熱鼓風干燥箱，上海蘇進儀器設備廠；pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；旋轉蒸發儀，南京惠恒科學儀器有限公司；冷凍干燥機，北京照生行儀器設備有限公司；酶標儀，美國BioTek公司。

1.2 FOs提取方法

1.2.1 米糠中不溶性膳食纖維的制備 參考袁小平的方法[11]稍加改進對原料進行預處理。將烘干的米糠過孔徑0.425 mm篩，滅菌，加入1 000 mL水，60℃連續攪拌16 h，使其充分溶脹；加入高峰α-淀粉酶、中性蛋白酶和糖化酶離心棄去上清液，沉淀用蒸餾水、95%乙醇和丙酮洗滌后，在40℃下干燥24 h，得到不溶性膳食纖維，備用。

1.2.2 FOs的提取流程 上述制備的米糠不溶性膳食纖維→加入用醋酸緩沖液配制的木聚糖酶液→恒溫水浴震蕩→沸水浴10 min滅酶活→冷卻→離心→收集上清液→離心→酶解液→旋轉蒸發、濃縮→冷凍干燥

1.2.3 FOs含量的測定 采用雙波長-紫外可見光分光光度法測定酶解液中FOs的含量[12]。在MOPS緩沖液（100 mmol/L，pH 6.0）中，阿魏酸在286 nm處有最大吸收值，FOs在323 nm處有最大吸收值。因此，采用雙波長分光光度法在286 nm和323 nm下測定混合物的吸光度。

1.3 酶解條件對FOs含量的影響

1.3.1 酶濃度對FOs含量的影響 稱取若干份5.00 g不溶性膳食纖維，分別加入125 mL濃度為1 400、1 500、1 600、1 700、1 800、1 900 U/mL木聚糖酶液，調節pH為4.0，50℃恒溫水浴震蕩24 h，沸水浴10 min后，離心，收集上清，采用雙波長法檢測上清中FOs濃度。

1.3.2 酶解溫度對FOs含量的影響 稱取若干份5.00 g不溶性膳食纖維，分別加入125 mL濃度為1 800 U/mL木聚糖酶液，調節pH為4.0，在 40、45、50、55、60℃恒溫水浴震蕩 24 h，沸水浴10 min后，離心，收集上清，采用雙波長法檢測上清中FOs濃度。

1.3.3 pH對FOs含量的影響 稱取若干份5.00 g不溶性膳食纖維，分別加入125 mL濃度為1 800 U/mL木聚糖酶液，分別調節pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在 50℃恒溫水浴震蕩24 h，沸水浴10 min后，離心，收集上清，采用雙波長法檢測上清中FOs濃度。

1.3.4 反應時間對FOs含量的影響 稱取若干份5.00 g不溶性膳食纖維，分別加入125 mL濃度為1 800 U/mL木聚糖酶液，調節pH為4.0，在 50℃恒溫水浴震蕩 1、2、6、12、18、24、30、36 h，沸水浴10 min后，離心，收集上清，采用雙波長法檢測上清中FOs濃度。

1.4 FOs的抗氧化活性測定

二苯基三硝基苯肼自由基（DPPH）清除能力的測定參照 Chen等[13]和牛生洋等[14]的測定方法進行。羥自由基清除能力的測定參照Zhang等[15]的方法進行。超氧陰離子自由基清除能力的測定參照王萍等[16]的方法進行。還原力的測定參照Lin等[17]的方法進行。

所有試驗于2017年6月至2018年5月在南京財經大學食品科學與工程學院實驗室完成。

2 結果與分析

2.1 FOs提取條件的優化

2.1.1 木聚糖酶濃度對FOs提取的影響 在料液比為1∶25（g/mL）、溫度為50℃、pH為4.0條件下水浴震蕩反應24 h，研究不同濃度木聚糖酶對酶解液中FOs含量的影響，結果見圖1。從圖1可以看出，酶濃度在1 000～1 800 U/mL時FOs提取量隨著酶濃度的升高而增多，當酶濃度超過1 800 U/mL時，FOs的含量反而下降。這可能是由于通常情況下隨著酶濃度的增加，酶促反應速度加快，即單位時間內生成的產物量增大；但當體系中酶濃度充足時，沒有多余的底物與酶結合，此時過量的酶反而會抑制酶反應的進行。因此，酶解米糠提取FOs時酶的濃度以1 800 U/mL為宜。

圖1 酶濃度對酶解液中FOs含量的影響

2.1.2 pH對FOs提取的影響 在料液比為1∶25（g/mL）、溫度為50℃、不同pH條件下反應24 h，測定酶解液中FOs的含量，結果見圖2。由圖2可知，在一定pH值范圍內，酶解液中的FOs含量隨著pH值的升高而增加，隨著pH繼續升高，酶解液中FOs含量呈下降趨勢。這可能是因為體系pH值的變化對酶的作用有很大影響，過酸或過堿均會影響酶的活性，使酶促反應受到抑制，甚至使酶失活從而大大降低反應速率。當體系pH值為4.0時，酶解液中的FOs含量達到最大值，即木聚糖酶反應的適宜pH值為4.0。

圖2 pH對酶解液中FOs含量的影響

2.1.3 反應時間對FOs提取的影響 在料液比為1∶25（g/mL）、pH為4.0、溫度為50℃條件下水浴震蕩反應，研究不同酶解時間對酶解液中FOs含量的影響，結果見圖3。從圖3可以看出，酶解液中的FOs含量隨著反應時間的增加而增大；在反應初期，FOs的增加速率較高，隨著反應不斷進行，FOs含量趨于穩定。這可能是由于經過一段時間的反應，體系中的底物已經基本消耗，濃度過低不利于酶促反應的進行，或者是反應過程中受溫度等因素影響部分酶失活，或者長時間反應產生對酶促反應有抑制作用的物質。故而，木聚糖酶酶解的適宜反應時間為24 h。

圖3 反應時間對酶解液中FOs含量的影響

2.1.4 溫度對FOs提取的影響 在料液比為1∶25（g/mL）、pH為4.0條件下水浴震蕩反應24 h，研究不同溫度條件對酶解液中FOs含量的影響，結果見圖4。由圖4可知，在一定范圍內，酶解液中的含量隨著溫度的升高而增加，繼續升高溫度后酶解液中FOs含量呈下降趨勢。這是由于在最適溫度下酶才能發揮最大活性，當反應溫度超過酶反應的最適溫度后，反應會受到抑制，甚至過高的溫度會使酶產生熱變性，從而大大降低反應速率。因此，當溫度在45℃時，酶解液中的FOs含量達到最大值，為0.93 mmol/L，即木聚糖酶反應的適宜溫度為45℃。

圖4 溫度對酶解液中FOs含量的影響

2.2 FOS抗氧化活性的研究結果分析

2.2.1 FOs對DPPH自由基清除率的影響DPPH是一種穩定的以氮為中心的人工合成自由基，其孤對電子在517 nm附近有強吸收（呈現深紫色），當抗氧化劑與其反應時，能夠配對其單電子而使其在517 nm左右的吸收峰迅速減弱，因此可通過測定吸收減弱的程度評價收受試物的的抗氧化活性[18]。

從表1可以看出，FOs對DPPH自由基具有較強的清除作用，當樣品濃度小于6 mg/mL時，隨著樣品濃度的升高清除率也升高，當樣品濃度大于6 mg/mL，隨著樣品濃度升高清除率基本不變。這可能是由于底物中自由基與抗氧化劑已經反應完全，沒有多余的自由基可被結合顯色。

表1 不同濃度FOs對不同自由基清除率的影響

2.2.2 FOs對羥自由基清除率的影響 羥自由基（·OH）是活性氧的一種，在H2O2-Fe2+體系中可以產生羥自由基，鄰二氮菲-Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+水溶液后，其在536 nm處最大吸收峰消失[11]。加入FOs進行反應，測定反應后混合物在536 nm處的吸光值可以推測出FOs的抗氧化能力。從表1可以看出，FOs對羥自由基有強的清除作用，并且隨著樣品含量的增加，對羥自由基的清除率不斷上升。當樣品濃度為8 mg/mL時，清除率達到了60%，繼續增加樣品濃度，清除率上升緩慢。

2.2.3 FOs對超氧陰離子自由基清除率的影響 鄰苯三酚在堿性條件下發生自氧化鏈式反應并釋放氧氣，氧氣又進一步加速鄰苯三酚的氧化，生成在可見光有吸收特征有色中間產物[19]。若在反應體系中加入抗氧化物質，可降低鄰苯三酚的自氧化速率，抑制中間產物的形成，使其反應溶液在325 nm處的吸光度減小。通過測定吸光度減小程度可評價受試物的抗氧化能力。從表1可以看出，FOs對超氧陰離子自由基有一定的清除作用，并且隨著樣品濃度的升高，對超氧陰離子的清除作用不斷增加。當樣品濃度為10 mg/mL時，清除率可達到63.85%，FOs對超氧陰離子的清除能力與樣品劑量呈正相關。

2.2.4 FOs對還原力的影響 一些酶類物質（如過氧化氫酶及NADH氧化酶等）以及一些非酶類化合物（如谷胱甘肽及抗壞血酸等）可以抑制ROS的產生，并控制Fe2+等過渡金屬離子的反應（如芬頓反應），從而有效防止氧化反應的發生，這種能力即被稱為還原能力[17]。從圖5可以看出，隨著樣品濃度的增加，吸光值也不斷升高。樣品濃度越大，對Fe3+的還原能力越強。

圖5 不同濃度FOs對還原力的影響

3 結論與討論

小麥、玉米和稻谷麩皮中主要活性成分是FOs，目前，關于FOs對氧化應激方面的研究主要集中在小麥和玉米麩皮中[19]。然而，對糙米米糠中的研究則比較少，少數研究集中在結構和免疫調節等方面[20]。本研究選擇酶水解法對米糠FOs進行提取，采用單因素定量分析方法，研究結果表明料液比為1∶25（g/mL）時，酶濃度為1 800 U/mL，pH 4.0，溫度45℃，反應24 h為適宜提取條件，在此條件下木聚糖酶的酶活基本穩定。這與先前研究結果相一致，先前研究表明木聚糖酶在溫度50℃以下、pH 4～6的反應條件下穩定性較強[11]。

在提取到米糠FOs的基礎上，選取多種抗氧化指標為參考因素，分析不同濃度FOs對DPPH、羥自由基、超氧陰離子自由基等的清除率和還原力變化進行檢測。從FOs對DPPH清除率的結果表明，在適宜濃度范圍內，FOs對DPPH清除率具有劑量依賴關系；通常情況下，酚酸抗氧化劑主要通過自由基DPPH直接從酚酸上抽取氫原子而發揮抗氧化作用，FOs對DPPH的清除率可能是歸功于阿魏酸基酚羥基的抽氫反應。FOs在一定程度上與脫氧核糖競爭，抑制羥基對脫氧核糖的降解，進而發揮抗氧化作用[11]。由于FOs對脫氧核糖降解的抑制，使得FOs對羥自由基的清除率呈劑量相關性，即隨著FOs濃度的增大，清除率上升。此外，FOs對超氧陰離子自由基的清除率也呈劑量依賴型關系。除了抗氧化能力以外，高效的還原能力能夠較好的恢復氧化損傷，本實驗的結果表明，FOs的還原力與FOs濃度密切相關，濃度越大，還原力越強。這與王萍等關于FOs的體外抗氧化研究結果[16]相一致。本實驗從抗氧化和氧化還原兩個角度出發，研究表明FOs具有明顯的抗氧化能力，并且能夠發揮氧化損傷修復作用，可作為一種潛在的天然抗氧化劑和還原劑，有效保護食品、保健品免受自由基誘導的氧化損傷和實現損傷修復。