心肌梗死小鼠microRNAs表達及干預后心功能變化的研究

魏麗萍，齊新，孫旭森，張宇凡

心力衰竭（heart failure，HF）是各種危重心血管疾病發展的終末階段，HF確診患者5年生存率僅為50%，被認為是危害人類健康的主要疾病之一[1]。近年來國內外研究者普遍認為，HF的本質是一種分子?臨床綜合征，基因表達調控異常與HF的發病機制密切相關[2]。心臟的病理生理變化與維持心功能的基因表達譜有關，而微小RNA（miRNAs）則是基因表達的重要調控者[3]。miRNAs是一類內源性非編碼單鏈小分子RNA，主要作用是通過誘導靶基因沉默參與轉錄后水平的基因表達調控[3?4]，特定miRNA的表達模式很大程度上取決于組織和細胞類型、代謝情況以及疾病狀態。既往研究發現，miRNAs可能在心力衰竭進展中起著上游調控的作用[4?6]。表觀遺傳學研究表明，miRNAs參與心力衰竭的多個基本病理過程，如心肌細胞凋亡、心肌纖維化、心肌肥厚和心臟重構等[5?6]。本研究通過建立C57BL/6 小鼠心肌梗死模型，檢測不同時間miRNA?1及miRNA?21的表達變化，同時觀察miRNA?1沉默及過表達miRNA?21后小鼠心肌功能及結構變化，旨在了解miRNAs的表達和心肌重構及心功能變化的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 6周齡雄性C57BL/6清潔級小鼠，體質量25～30 g，購自第四軍醫大學動物中心。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，cDNA反轉錄試劑盒、ABI 7500實時熒光PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。人工設計合成的miRNA?1阻斷劑（Antagomir，用于沉默目標miRNA）、慢病毒（lentiviral）載體pPS?EF1?copGFP?LCS（報告基因為GFP，用于過表達目標miRNA）均購自上海吉瑪生物制劑公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌梗死模型制備 小鼠用2%異氟烷誘導麻醉后，剪開左側胸骨，暴露冠狀動脈，用6–0號絲線結扎冠狀動脈前降支中段，之后關胸，等待麻醉蘇醒后放入飼養籠內。假手術組給予同樣的外科術式，但不結扎前降支中段。因手術時間短，建立了無需機械通氣，麻醉后快速復蘇的手術方法，實驗動物存活率高，模型成功率達80%。72只小鼠建模成功后1周按隨機數字表法分為心肌梗死組（MI組），miRNA?1干預組（干預1組）及miRNA?21干預組（干預2組），每組24只，每個觀察時間段6只，另有假手術組6只，用于收集各項實驗基礎數據（0周數據）。干預1組于心肌梗死區及周邊組織注射人工合成的 miRNA?1 Antagomir（1×109TU/mL）來阻斷miRNA?1表達，注射劑量為30 μL。干預2組先從基因組中擴增miRNA?21，然后將其克隆入pPS?EF1?copGFP?LCS，注射劑量為30 μL，1×109TU/mL，于制備心肌梗死模型時結扎左前降支后在心肌內多點注射以感染心肌細胞，使miRNA?21基因過表達，觀察功能效應。各組于4、8、12及16周后進行心臟超聲檢查，檢查后處死動物，獲取心肌梗死區及心肌梗死周邊區組織進行miRNAs測定。

1.2.2 心功能各項指標的檢測 Vevo 770 high resolution system超聲儀檢測心肌梗死模型成功后4、8、12及16周左室舒張末期內徑（LVDD）、左室射血分數（LVEF）、左室心肌質量（LVMass）等心功能指標，評估心室重構程度。

1.2.3 熒光定量PCR檢測miRNAs基因表達 （1）miRNA?1上游：5′?CGTGGTGAGCAAGTATGTAAAA?3′，miRNA?21上游：5′?CCTTAGGCAGACTGATGTTGAAAA?3′，內參對照為U6。（2）組織RNA的提取：取適量組織至1.5 mL EP管中，用剪刀剪碎組織后加Trizol 1 mL后用玻璃棒研磨，充分震蕩均勻，按照常規方法提取溶解RNA，?80℃保存備用。之后進行純度檢測和總RNA完整性檢測。（3）逆轉錄反應：取RNA模板4 μL，引物miRNA?1、miRNA?21、U6各1 μL，5×ScriptTM緩沖液1 μL，ScriptTMRT酶MixⅠ 1 μL，加去RNA水至總體積20 μL。逆轉錄條件：37℃水浴箱中2 h，待轉錄結束后再置于95℃金屬浴中5 min，然后立即置于冰盒上。（4）熒光定量PCR反應：逆轉錄反應產物cDNA 2 μL，SYBR Premix Dimer Eraser（2×）10 μL，20×引物各1 μL、加水至總體積20 μL。反應條件：預變性95℃ 1 min；變性85 ℃ 5 min，退火 53 ℃ 60 s，40 個循環。熒光定量 PCR 和 2－ΔΔCt法分析miRNA?1、miRNA?21基因相對表達量：其中，ΔCt=Ct目的基因?Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組?ΔCt對照組。

1.3 統計學方法 應用SPSS 16.0軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD?t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 靶基因表達的改變對心肌梗死小鼠心臟結構和功能的影響

2.1.1 miRNA?1在MI組及干預1組表達的比較 2組miRNA?1的表達量在梗死4周時即升高，8周時繼續保持升高，12周時表達最高，至16周時仍呈高表達狀態。干預1組建模后4、8、12和16周miRNA?1表達量均低于MI組（P＜0.01），見表1。

2.1.2 miRNA?21在MI組及干預2組中表達水平的比較 miRNA?21在MI組心肌梗死后4周表達略升高，后于8、12、16周呈降低趨勢，而干預2組4周時高于0周，在8、12、16周miRNA?21表達高于0周，且均高于MI組（P＜0.01），見表2。

2.2 不同時段各組超聲指標比較 MI組心肌梗死后4周可出現左室前壁部分室壁厚度明顯變薄，左室短軸切面顯示左室前壁、前間壁心肌結構消失。隨后8～16周隨心肌梗死時間延長，心肌回聲增強，室壁變薄，運動幅度逐漸減弱或消失。隨著心肌梗死的進展，LVDD擴大，心室發生重構，LVmass增加，LVEF逐漸降低。干預1組心肌梗死8周和12周時LVDD小于MI組，8、12、16周時LVEF大于MI組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。干預2組心肌梗死12周時LVDD小于MI組，12周和16周時LVEF大于MI組，心肌梗死12周時LVMass小于MI組，見圖2。干預組12周時心肌回聲增加趨勢較MI組均有減弱，見圖3。

Tab.1 Comparison of the expression of miRNA-1 in myocardium between MI group and miRNA-1 antagomir group表1 miRNA-1在MI組及干預1組表達的比較 （n=6，±s）

Tab.1 Comparison of the expression of miRNA-1 in myocardium between MI group and miRNA-1 antagomir group表1 miRNA-1在MI組及干預1組表達的比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與同組0周比較，P＜0.05；表2同

組別MI組干預1組t 0周1.12±0.15 1.12±0.15?4周16.19±1.87a 6.89±0.68a 11.485＊＊8周17.78±2.02a 8.93±0.89a 9.803＊＊12周28.58±2.15a 14.63±1.67a 12.554＊＊16周25.18±2.50a 12.16±1.07a 11.739＊＊F 183.710＊＊155.146＊＊

Tab.2 Comparison of the expression of miRNA-21 in myocardium between MI group and miRNA-21 lentiviral group表2 miRNA-21在MI組及干預2組心肌組織表達的比較 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of the expression of miRNA-21 in myocardium between MI group and miRNA-21 lentiviral group表2 miRNA-21在MI組及干預2組心肌組織表達的比較 （n=6，±s）

組別0周4周8周12周16周F MI組干預2組t 1.07±0.14 1.07±0.14?3.54±0.22a 1.96±0.24a 11.959＊＊0.46±0.21a 2.09±0.21a 13.224＊＊0.45±0.18a 2.09±0.22a 14.401＊＊0.34±0.20a 2.27±0.24a 15.400＊＊303.844＊＊30.227＊＊

Fig.1 Comparison of ultrasound indicators between MI group and intervention group 1 at different time points圖1 不同時段MI組與干預1組超聲指標比較

3 討論

心臟的病理生理變化與維持心功能的基因表達譜有關，miRNAs是基因表達變化的重要調控者。miRNAs可能在心力衰竭病程進展中起著上游調控的作用[7?8]。心肌細胞中分布最廣泛且與心臟發育有關的microRNA是miRNA?1，miRNA?1是由兩個幾乎完全相同的基因（miRNA?1和miRNA?1?1）編碼，位于E3?泛素?蛋白連接酶的內部[9]。心肌細胞凋亡與miRNA?1的異常表達密切相關，miRNA?1基因缺失的動物將會出現各種心臟異常。Tang等[10]發現miRNA?1的過表達加重了H2O2誘發的心肌細胞凋亡，而使用寡核甘酸抑制miRNA?1表達后，心肌細胞對H2O2產生了耐藥性。Glass 等[11]將miRNA?1胚胎干細胞（miRNA?1?1?ES）移植到c7BL/6小鼠前降支結扎后心肌梗死邊緣區域，發現miRNA?1?1?ES可抑制宿主心肌細胞梗死過程中p?AKT通路激活誘導的細胞凋亡，心臟功能得到了顯著改善。Cheng等[12]發現血清miRNA?1在心肌梗死后迅速增加，在6 h達到峰值，并在第3天恢復到基礎水平，血清miRNA?1水平和心肌梗死面積呈正相關。Zhao等[13]發現miRNA?1基因敲除可以導致小鼠心臟電傳導、細胞周期和一系列的生物效應變化。Lu等[14]研究顯示，miRNA?1參與調節心臟衰竭和心律失常，普萘洛爾可降低心肌梗死后高表達的miRNA?1，抑制炎癥應答因子表達。

Fig.2 Comparison of ultrasound indicators between MI group and intervention group 2 at different time points圖2 不同時段MI與干預2組超聲指標比較

成體心臟對于損傷及過負荷的反應為激活不同系列的細胞內信號轉導通路及基因調控因子，從而促進細胞增殖、胚胎基因表達及細胞外基質重構。miRNA?21調控ERK?MAP信號系統可影響心臟結構和功能，導致左室擴大，進展性的心肌纖維化，心力衰竭及心律失常[15]。miRNA?21是公認的調控心臟發育，可使胚胎基因在心肌細胞中激活的一類miRNAs，但miRNA?21在心肌纖維化中的作用，研究結果并不一致。Cheng等[16]報道寡核苷酸介導miRNA?21基因沉默后可抑制心肌細胞增殖。而Tatsuguchi等[17]報道miRNA?21基因敲除可加重心肌纖維化。但值得注意的是，無論是正性作用還是負性作用，miRNA?21均可調控細胞增殖，抑制凋亡。Dong等[18]報道心肌梗死早期miRNA?21在心肌梗死區域是低表達的，miRNA?21具有一定程度的抗凋亡作用。

研究發現，miRNA?1、miRNA?29、miRNA?30、miRNA?133及miRNA?150是在心力衰竭中表達上調 ，而 miRNA?21、miRNA?23a、miRNA?125、miRNA?195、miRNA?199及 miRNA?214在心力衰竭、心肌纖維化中表達下調[19]。

Fig.3 Comparison of ultrasonic images in 12 weeks between intervention group and un?intervention group圖3 12周時干預后與未干預組比較

本研究關注了在心臟廣泛分布的兩種miRNAs，即miRNA?1和miRNA?21[8，20]，觀察心肌梗死后不同時期兩種miRNAs的表達情況，并分別給予經典的基因沉默和過表達干預后觀察兩種miRNAs的表達及心肌功能、心室重構情況的變化。結果表明，MI組miRNA?1的表達量在梗死4周時即升高，12周時表達最高，至16周時仍呈高表達狀態，而阻斷miRNA?1表達后，miRNA?1表達明顯降低。miRNA?21在心肌梗死后4周表達略升高，后于8、12、16周明顯降低，而應用慢病毒載體過表達miRNA?21后，各時段miRNA?21表達明顯升高。心肌功能觀察發現模型小鼠心肌梗死后4周可出現左室前壁部分室壁厚度明顯變薄，左室短軸切面顯示左室前壁、前間壁心肌結構消失，隨后觀察8周、12周、16周時心肌結構改變明顯，心肌回聲增強，室壁變薄，運動幅度減弱或消失。沉默miRNA?1表達后，于心肌梗死8周及12周時大鼠LVDD較MI組縮小，而過表達miRNA?21后，于心肌梗死12周時LVDD也較MI組縮小，同時LVEF于12周及16周時較MI組有明顯改善，LVmass于心肌梗死12周時可見降低。心肌回聲增加趨勢較MI組不同時段均有減弱。

從實驗結果分析，心肌梗死發生過程中，miRNA?1及miRNA?21在不同時間表達是變化的，給予相應干預后心功能及心室重構情況較未干預組在不同時間有所改善，結合既往研究，筆者推測miRNA?1及miRNA?21參與心力衰竭的多個基本病理過程，如心肌細胞凋亡、心肌纖維化和心臟重構等過程。miRNA?1和miRNA?21可能在早期心力衰竭、心室重構及心肌纖維化調控的過程中起到更為重要的作用。