懸浮球培養法制備ABCG2陽性表達胃癌細胞株

梅海軍，劉建明

南通大學附屬醫院普通外科，南通 226001

腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)是指腫瘤組織中一小部分亞群細胞，具有極強的成瘤能力，是腫瘤發生、發展及轉移的基礎[1-2]。深入研究CSCs的生物學特性，探討調控CSCs的生物學行為機制，能夠為腫瘤的臨床治療提供新的參考依據。腫瘤細胞懸浮成球實驗被認為是獲取腫瘤干細胞的方法之一。

懸浮球培養法已在許多實體腫瘤中成功分離出腫瘤干細胞，但該方法能否成功培育出胃癌腫瘤干細胞仍不明確。因此，本研究選用胃癌細胞株MKN45在無血清干細胞培養基中進行懸浮培養，從中分離出懸浮球細胞，檢測懸浮球細胞干細胞標志物ATP結合盒蛋白亞家族2(ATP-binding cassette sub-family G member 2, ABCG2)的表達情況，探討懸浮球培養法制備ABCG2陽性表達胃癌腫瘤干細胞的可行性。

1 資料與方法

1.1 主要材料及試劑 人胃癌細胞株MKN45購自中國科學院上海生命科學院細胞庫，青霉素/鏈霉素購于Thermo公司，人成纖維細胞生長因子2(FGF-2)及表皮生長因子(EGF)購自Sigma公司，ABCG2抗體購自Abcam公司，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液、1.5 mol/LTris-HCl pH 8.8、1 mol/LTris-HCl(pH 6.8)、TEMED、增強型化學發光試劑盒均購自碧云天公司；甘氨酸(電泳級)、過硫酸胺(APS)均購自Sigma-Aldrich公司。RNA提取試劑試劑盒(RNAiso Plus)購自TaKaRa公司，MultiScribe Reverse Transcriptase購自Applied Biosystems公司；SYBRGreen PCR Supermix購自Bio-Rad公司，Diethypyrocarbonate(DEPC)水購自碧云天公司。

1.2 胃癌細胞培養 MKN45細胞培養在37℃、含5% CO2的環境中，培養液均為RPMI 1640培養基，含10%胎牛血清(FBS)，以及青霉素62.5 mg/L、鏈霉素100 mg/L，添加人FGF-2濃度20 ng/mL及EGF濃度100 ng/mL。細胞生長于T-75組織培養曲頸瓶中，2 d更換培養基1次，觀察懸浮球形成狀態，每孔約100個細胞，14 d后在顯微鏡下放大40及100倍觀察懸浮球形成情況。懸浮球長到約300～600個細胞時，用滴管將球體吹開，細胞密度約為1 000/mL。在96孔低吸附板中，每孔加入100 μL單細胞懸液，14 d后觀察懸浮球形成狀態，原代貼壁培養細胞作為對照組進行觀察。

1.3 實時熒光定量 PCR每1×106細胞中，加入1 mL TRIzol試劑，用1 mL移液槍吹至液體澄清且無細胞團塊并轉移入1.5 mL EP管中，按照TaKaRa公司總RNA提取試劑盒操作提取總RNA，并進行RNA定量。按照RT-PCR試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA，按照Thermal Cycler DiceTMReal Time System(TaKaRa Code：TP800)使用說明書要求進行PCR試驗操作。待測基因引物序列如下，ABCG2-F：5′-TGA GGG TTT GGA ACT GTG G-3′；ABCG2-R：5′-GAT TCT GAC GCA CAC CTG G-3′；GAPDH-F：5′-GGC ATC CTG GGC TAC ACT-3′；GAPDH-R：5′-CCA CCA CCC TGT TGC TGT-3′。定量PCR反應條件：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，Tm 15 s，72℃ 30 s，45個循環；熔解曲線分析：95℃ 15 s，70℃ 15 s。每組實驗重復3次，采用Livak法半定量分析RT-PCR檢測結果。

1.4 Western印跡法檢測蛋白表達水平 PBS洗滌細胞1次后，置于冰板上，用細胞刮子將細胞刮下收集，8 000 r/min×1 min離心得到細胞沉淀，每20 μL體積中加入100 μL RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min 后，超聲破碎5次，每次2 s，15 000 r/min×10 min離心得到上清即為提取到的總蛋白樣品。BCA法測定蛋白含量。蛋白樣品按體積比3∶1加入上樣緩沖液并煮沸5 min。制備8%SDS-PAGE，對樣品進行電泳分離。電泳分離后，進行濕電轉移，將蛋白轉至PVDF膜。PVDF膜在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉1 h后，4℃孵育一抗過夜，相應二抗室溫孵育1 h，ECL顯影，Bio-Rad凝膠成像儀成像。

2 結 果

2.1 胃癌細胞懸浮球體的形成 在無血清培養基中，胃癌MKN45細胞培養4 d后開始逐漸形成細胞球體形狀，繼續培養，8～14 d形成較為完整的懸浮球體，球體中心細胞密度變大。繼續培養至21 d，形成完整的懸浮球體，球體中心胃癌細胞密度增大，排列緊密(圖1)。將第1代懸浮球體用滴管吹散后，在無血清培養基中繼續培養，顯微鏡下觀察，培養基中形成的細胞球體進一步增多，成球率高達(36.12±7.53)%。而原代貼壁培養細胞組成球率為(4.10±1.21)%，兩組成球率差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 胃癌細胞MKN45無血清培養21 d后形成的懸浮球體

2.2 懸浮球細胞ABCG2的表達水平 實時熒光定量PCR結果(圖2A)顯示：懸浮球細胞ABCG2 mRNA表達水平高于原代貼壁細胞，差異有統計學意義(P<0.05)。Western印跡結果(圖2B)顯示：懸浮球細胞ABCG2蛋白表達水平高于原代貼壁培養細胞，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 原代貼壁細胞及懸浮球體細胞ABCG2的表達

3 討 論

癌細胞的廣泛侵襲和轉移是胃癌患者最主要的死因，特別是難以控制的遠隔重要臟器的轉移[3]。CSCs在腫瘤轉移過程中扮演的角色至關重要。ABCG2是ABC超家族成員之一，又被稱為乳腺癌耐藥蛋白，該蛋白作為外源性轉運蛋白發揮作用，對化療藥物(包括米托蒽醌和喜樹堿藥物)的多藥耐藥起重要作用[4]。其在胎盤中表達顯著增高，在母體循環中具有保護胎兒免受外來物質影響的作用，在肝臟和腎臟上皮細胞的頂端膜中，能夠增強外源性物質的排泄[5]。在哺乳期的乳腺中，它具有將核黃素和生物素等分泌到乳汁中的作用；在腎臟和胃腸道中，它具有促進尿酸排泄的作用[6-7]。

ABCG2基因在許多惡性腫瘤細胞質膜上高表達，從而導致惡性腫瘤細胞能夠將抗腫瘤藥物泵出細胞外產生抗藥性[8-9]。在對膠質瘤、黑素瘤等惡性腫瘤患者進行治療的過程中，加入針對不同ABCG2突變體的拮抗劑可能會出現更好的療效。進一步研究發現，ABCG2在膠質瘤、黑素瘤等腫瘤干細胞細胞膜上的表達特異性增高，提示ABCG2可能會成為這些腫瘤干細胞陽性篩選的潛在標志物[10]。

本研究結果顯示，胃癌細胞株MKN45在含有FGF-2及EGF的無血清培養基中培養21 d，能夠形成完整的懸浮球體，成球率明顯高于原代貼壁細胞。

懸浮球體細胞內的ABCG2蛋白表達及mRNA表達水平均顯著高于原代貼壁細胞，提示采用懸浮球培養法在胃癌細胞株MKN45中培養的懸浮球體細胞具有CSCs特性。該方法有望成為胃癌干細胞研究新的造模方法，為后續研究奠定了基礎。