懸浮球培養法制備ABCG2陽性表達胃癌細胞株

梅海軍，劉建明

南通大學附屬醫院普通外科，南通 226001

腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)是指腫瘤組織中一小部分亞群細胞，具有極強的成瘤能力，是腫瘤發生、發展及轉移的基礎[1-2]。深入研究CSCs的生物學特性，探討調控CSCs的生物學行為機制，能夠為腫瘤的臨床治療提供新的參考依據。腫瘤細胞懸浮成球實驗被認為是獲取腫瘤干細胞的方法之一。

懸浮球培養法已在許多實體腫瘤中成功分離出腫瘤干細胞，但該方法能否成功培育出胃癌腫瘤干細胞仍不明確。因此，本研究選用胃癌細胞株MKN45在無血清干細胞培養基中進行懸浮培養，從中分離出懸浮球細胞，檢測懸浮球細胞干細胞標志物ATP結合盒蛋白亞家族2(ATP-binding cassette sub-family G member 2, ABCG2)的表達情況，探討懸浮球培養法制備ABCG2陽性表達胃癌腫瘤干細胞的可行性。

1 資料與方法

1.1 主要材料及試劑 人胃癌細胞株MKN45購自中國科學院上海生命科學院細胞庫，青霉素/鏈霉素購于Thermo公司，人成纖維細胞生長因子2(FGF-2)及表皮生長因子(EGF)購自Sigma公司，ABCG2抗體購自Abcam公司，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液、1.5 mol/LTris-HCl pH 8.8、1 mol/LTris-HCl(pH 6.8)、TEMED、增強型化學發光試劑盒均購自碧云天公司；甘氨酸(電泳級)、過硫酸胺(APS)均購自Sigma-Aldrich公司。RNA提取試劑試劑盒(RNAiso Plus)購自TaKaRa公司，MultiScribe Reverse Transcriptase購自Applied Biosystems公司；SYBRGreen PCR Supermix購自Bio-Rad公司，Diethypyrocarbonate(DEPC)水購自碧云天公司。

1.2 胃癌細胞培養 MKN45細胞培養在37℃、含5% CO2的環境中，培養液均為RPMI 1640培養基，含10%胎牛血清(FBS)，以及青霉素62.5 mg/L、鏈霉素100 mg/L，添加人FGF-2濃度20 ng/mL及EGF濃度100 ng/mL。細胞生長于T-75組織培養曲頸瓶中，2 d更換培養基1次，觀察懸浮球形成狀態，每孔約100個細胞，14 d后在顯微鏡下放大40及100倍觀察懸浮球形成情況。……