Bcl2促進UMR-106細胞BMP-2、OPG表達及補腎健脾活血方對其影響

王吉利 張志海 黃宏興 萬雷 劉海全 柴爽 汪悅東

1. 廣州中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 5104052. 廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州 5102003. 廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學研究中心中醫(yī)骨傷科學實驗室，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP) 是以骨量低，骨組織微結構損壞，骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1]。凋亡作為細胞的一種死亡方式，在調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松形成的過程中發(fā)揮重要的作用[2]。補腎健脾活血方由肉蓯蓉、補骨脂、制淫羊藿等10味中藥組成，前期研究發(fā)現(xiàn)補腎健脾活血方可以提高OVX的骨密度[3]和骨骼肌中B淋巴細胞瘤-2(B lymphocyte tumor-2，Bcl-2)蛋白表達[4]。但是Bcl2作用于成骨細胞的機制和中藥如何調(diào)節(jié)的研究尚少，本研究通過構建沉默Bcl2和過表達Bcl2腺病毒，過表達和沉默大鼠成骨細胞UMR-106中Bcl2的表達，從凋亡因子Bcl2角度研究凋亡因子對成骨細胞成骨分化的影響，及補腎健脾活血方對Bcl2凋亡損傷成骨細胞的保護作用，為中藥應用于臨床提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑

大鼠成骨細胞UMR-106購自中國科學院上海細胞庫。補腎健脾活血方藥物肉蓯蓉、補骨脂、制淫羊藿等10味中藥購買于廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院。0.25%胰酶、α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液(Gibco公司，美國)，PBS(HyCione公司，美國)，蛋白質(zhì)裂解液、一抗稀釋液、ECL化學發(fā)光試劑、蛋白測定試劑盒、凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，兔抗鼠多克隆抗體Bcl2、兔抗鼠多克隆抗體OPG(美國 Abcam 公司)，兔抗鼠多克隆抗體BMP-2(四正柏公司)，兔抗鼠GAPDH多克隆抗體、兔抗鼠Tubulin多克隆抗體(ABclonal公司),二抗羊抗兔HRP-IgG(CST公司)。

1.2 儀器

高速冷凍離心機(德國 sigma 公司)，渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器)，電泳儀/轉膜儀(BioRad公司)、凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，組織破碎儀(gering)、低速離心機(Eppendorf)、水浴鍋(上海一恒)、生物安全柜(the baker companry)、HERACell 150i 細胞培養(yǎng)箱(Thermo scientific)、LEICA DM IL 倒置熒光顯微鏡(徠卡，德國)。

1.3 方法

1.3.1構建病毒：提取大鼠肌肉組織總RNA，逆轉錄，使用TOYOBO NEO Plus，PCR克隆，用1×TAE配制1%瓊脂糖凝膠，取5 μL進行電泳(120 V 約30 min)鑒定，經(jīng)過純化，膠回收，酶切后，分別取酶切的載體pdc316-mcmv-eGFP和Bcl2 PCR酶切產(chǎn)物，菌落PCR鑒定及測序正確后，將含正確目的基因序列的菌落接種于含amp抗性的20 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min過夜搖菌，提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒，使用含目的基因的pdc316-mcmv-eGFP與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHG(delta)E1，進行共轉細胞，腺病毒濃縮與純化后進行后續(xù)實驗。

1.3.2細胞培養(yǎng)：UMR-106 細胞接種于含10% 胎牛血清及1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液中，在 37 ℃、5% CO2條件下進行培養(yǎng)，平均3 d 換1 次液，2～3 d進行1次傳代，傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。

1.3.3含藥血清制備：將12周齡SD雌性大鼠分為2組，對照組、中劑量組(4.8 g/kg),每日分2次給藥，期間間隔8 h，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h后腹主動脈采血，室溫靜置1 h后，4 ℃，3 000 r/min 離心15 min，棄上部血清，56 ℃ 30 min滅活，用22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4Bcl2腺病毒干預及細胞分組：將培養(yǎng)的 UMR-106細胞隨機分為空載腺病毒組(沉默Bcl2空載腺病毒NC-bcl2，過表達Bcl2空載腺病毒 WT-bcl2)、 Bcl2腺病毒組(沉默Bcl2腺病毒 sh-bcl2，過表達Bcl2腺病毒 Ad-bcl2)，均用α-MEM培養(yǎng)液完全培養(yǎng)基，貼壁后加入空載病毒和腺病毒，過夜后換液。同時連續(xù)作用 42 h。各組細胞培養(yǎng)結束后進行各項指標的檢測。

1.3.5中藥含藥血清干預及細胞分組：將培養(yǎng)的UMR-106細胞隨機分為空載腺病毒+空白血清組(沉默Bcl2空載腺病毒 NC-bcl2，過表達Bcl2空載腺病毒 WT-bcl2)、空載腺病毒+補腎健脾活血方含藥血清組(沉默Bcl2空載藥物組NC-bcl2+ME，過表達Bcl2空載藥物組 WT-bcl2+ME)、Bcl2腺病毒+空白血清組(沉默Bcl2腺病毒 sh-bcl2，過表達Bcl2空載腺病毒 Ad-bcl2)、Bcl2腺病毒+補腎健脾活血方含藥血清組(沉默Bcl2腺病毒藥物組 sh-bcl2+ME，過表達Bcl2腺病毒藥物組 Ad-bcl2+ME)，貼壁后分別加入空載病毒和腺病毒，過夜后換液，空載腺病毒組及Bcl2腺病毒藥物組換空白血清，空載腺病毒藥物組和Bcl2腺病毒藥物組換含藥血清。同時連續(xù)作用 42 h。各組細胞培養(yǎng)結束后進行各項指標的檢測。

1.3.6PCR檢測Bcl2、OPG的表達：采用Takara試劑說明書提取細胞的總RNA，各組取500ng的RNA加入dd H2O與逆轉錄試劑配成10 μL體系，以完成逆轉，以cDNA為模板按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ說明書操作加入相應的試劑及引物最終成15 μL體積進行PCR擴增,具體反應條件：95 ℃預變性10 s；95 ℃變性 30 s，60 ℃ 退火50 s，72 ℃ 延伸 15 s，40個循環(huán)。以BIO-RAD型PCR熱循環(huán)儀分析軟件，將相對定量值RQ及處理后CT值用于統(tǒng)計分析。引物序列如表3。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.7Western blot 技術檢測細胞成骨相關蛋白BMP-2、OPG表達情況：分別收集各組細胞，含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的IP裂解液提取蛋白，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。以 20 μg 蛋白/泳道上樣，經(jīng) SDS-PAGE 電泳后，轉膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，按比例配制Bcl2、BMP-2、OPG及GADPH 一抗，4 ℃ 封閉過夜，TBST 洗滌 3 次，每次5 min，加入HRP標記的羊抗兔二抗。按1∶1比例配制化學發(fā)光液，將膜放在曝光板上，應用全自動熒光與可見光凝膠成像分析系統(tǒng)曝光分析圖片。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 病毒轉染UMR-106細胞

圖1為病毒轉染細胞后，熒光顯微鏡拍攝，顯示沉默Bcl2基因、過表達Bcl2基因、空載腺病毒轉染UMR-106細胞。

圖1 病毒轉染細胞熒光表達注：×200；A:Si病毒轉染，濃度12.8×108 μL；B:NC病毒轉染，濃度12.8×108 μL；C:sh-bcl2病毒轉染，濃度16×108 μL；D:Ad-bcl2病毒轉染，濃度12.8×108 μLFig.1 Fluorescence expression of virus transfection cellsNote: ×200; A: Si virus transfection, concentration 12.8×108 μL; B: NC virus transfection, concentration 12.8×108 μL; C: sh-bcl2 virus transfection, concentration of 16×108 μL; D: Ad-bcl2 virus transfection, concentration of 12.8×108 μL

2.2 病毒轉染細胞Bcl2的表達

在UMR-106細胞中，與NC-bcl2比較，Sh-bcl2可以降低Bcl2的表達(P<0.05)、沉默Bcl2蛋白的表達；與WT-bcl2比較，Ad-bcl2可以增加Bcl2的表達(P<0.05)，過表達Bcl2蛋白，腺病毒構建成功，可以進行后續(xù)實驗。見圖2。

圖2 sh-bcl2和Ad-bcl2干預UMR-106細胞 bcl2蛋白表達注：與空載腺病毒比較：*P<0.05；A：sh-bcl2干預UMR-106細胞 Bcl2蛋白表達；B：sh-bcl2干預UMR-106細胞 bcl2灰度分析； C：Ad-bcl2干預UMR-106細胞 Bcl2蛋白表達；D：Ad-bcl2干預UMR-106細胞 bcl2灰度分析Fig.2 Bcl2 protein expression interfered by sh-bcl2 and Ad-bcl2,Note: compared with Black adenovirus:*P<0.05; A: Bcl2 protein expression interfered by sh-bcl2 in UMR-106 cells; B: Bcl2 grayscale analysis interfered by sh-bcl2 in UMR-106 cells; C: Bcl2 protein expression interfered by Ad-bcl2 in UMR-106 cells; D: Bcl2 grayscale analysis interfered by Ad-bcl2 in UMR-106 cells

2.3 bcl2對成骨細胞BMP-2、OPG的表達

在UMR-106細胞中，與NC-bcl2比較，sh-bcl2可以降低BMP-2、OPG蛋白的表達(均P<0.05)；與WT-bcl2比較，Ad-bcl2可以提高BMP-2、OPG蛋白的表達(均P<0.05)。Bcl2可以作用于成骨細胞，促進成骨相關蛋白BMP-2、OPG蛋白的表達。見圖3。

圖3 sh-bcl2和Ad-bcl2干預UMR-106細胞BMP-2、OPG蛋白表達注：*P<0.05；A：sh-bcl2病毒干預UMR-106細胞BMP-2、OPG蛋白表達；B：sh-bcl2病毒干預UMR-106細胞表達BMP-2灰度分析；C：sh-bcl2病毒干預UMR-106細胞 OPG灰度分析；D：Ad-bcl2病毒干預UMR-106細胞BMP-2、OPG蛋白表達；E：Ad-bcl2病毒干預UMR-106細胞BMP-2灰度分析；F：Ad-bcl2病毒干預UMR-106細胞OPG灰度分析Fig.3 BMP-2 and OPG protein expression interfered by sh-bcl2 and Ad-bcl2Note: *P <0.05; A: BMP-2 and OPG protein expression interfered by sh-bcl2 virus in UMR-106 cells; B: BMP-2 grayscale analysis interfered by sh-bcl2 virus in UMR-106 cells; C: OPG grayscale analysis interfered by sh-bcl2 virus in UMR-106 cells; D: BMP-2 and OPG protein expression interfered by Ad-bcl2 virus; E: BMP-2 grayscale analysis interfered by Ad-bcl2 virus in UMR-106 cells; F: OPG grayscale analysis interfered by Ad-bcl2 virus in UMR-106 cells

2.4 Bcl2對bcl2、OPG mRNA的表達

在UMR-106細胞中，sh-bcl2降低Bcl2基因的表達(P<0.05)，沉默和過表達Bcl2后，mRNA OPG的表達未見明顯變化。沉默和過表達Bcl2可能沒有影響到OPG基因改變。見表2、表3。

表2 sh-Bcl2干預UMR-106細胞 Bcl2、OPG mRNA的表達

注：*P<0.05

表3 Ad-Bcl2干預UMR-106細胞 OPG mRNA的表達

2.5 中藥對沉默和過表達Bcl2后BMP-2、OPG的影響

在空載腺病毒干預中，與大鼠空白血清相比，大鼠補腎健脾活血方含藥血清干預細胞后，均可以增加BMP-2、OPG蛋白的表達，但是在過表達Bcl2中，補腎健脾活血方含藥血清不影響B(tài)MP-2蛋白的表達；在空白血清干預的細胞中，sh-bcl2可以抑制BMP-2、OPG蛋白的表達，Ad-bcl2起到相反的作用；在sh-bcl2干預的細胞中，含藥血清提高BMP-2、OPG蛋白的表達；在Ad-bcl2干預的細胞中，中藥干預后，BMP-2、OPG未見明顯改變。見圖4。

圖4 中藥分別于sh-bcl2、Ad-bcl2干預UMR-106細胞BMP-2、OPG蛋白表達注：*P<0.05；A：sh-bcl2病毒和中藥干預UMR-106細胞BMP-2、OPG蛋白表達；B：sh-bcl2病毒和中藥UMR-106細胞表達BMP-2灰度分析；C：sh-bcl2病毒和中藥干預UMR-106細胞表達OPG灰度分析；D：Ad-bcl2病毒和中藥干預UMR-106細胞BMP-2、OPG蛋白表達；E：Ad-bcl2病毒和中藥干預UMR-106細胞表達BMP-2灰度分析；F：Ad-bcl2病毒和中藥干預UMR-106細胞表達OPG灰度分析Fig.4 BMP-2 and OPG protein expression interfered by traditional Chinese medicine with sh-bcl2 and Ad-bcl2,Note:*P< 0.05; A: BMP-2 and OPG protein expression interfered by sh-bcl2 virus and traditional Chinese medicine interfering in UMR-106 cells; B: BMP-2 grayscale analysis interfered by sh-bcl2 virus and TCM in UMR-106 cells; C: OPG grayscale analysis interfered by sh-bcl2 virus and TCM intervention in UMR-106 cells; D: BMP-2 and OPG protein expression interfered by Ad-bcl2 virus and traditional Chinese medicine; E: BMP-2 grayscale analysis interfered by Ad-bcl2 virus and TCM intervention in UMR-106 cells; F: OPG grayscale analysis interfered by Ad-bcl2 virus and TCM intervention in UMR-106 cells

3 討論

OP在古籍文獻中尚無明顯記載，多將其歸屬于《黃帝內(nèi)經(jīng)》 中“骨痹”、“骨痿”等范疇。單純依靠補鈣或抗骨質(zhì)疏松等藥物防治OP，方法顯得較為單薄，而依靠中醫(yī)藥理論及治療方法在預防該病方面優(yōu)勢凸顯[5]。中醫(yī)認為OP的發(fā)生與腎虛、脾虛、血瘀有關，因此OP治療原則為補腎、健脾、活血，故多以補腎、健脾、活血藥物輔助治療骨病[6]，在中醫(yī)理論的指導下，補腎健脾活血方由右歸飲(《景岳全書》)合肉蓯蓉湯(《圣濟總錄》)加減化裁而來，進而治療骨質(zhì)疏松。

中老年人由于機能的退化，成骨細胞和破骨細胞平衡失調(diào)[7]，容易發(fā)生OP。在OP與非OP患者標本中發(fā)現(xiàn)血清和骨組織中Bcl-2表達與腰椎骨密度呈正相關[8, 9]，Moriishi等[2]研究發(fā)現(xiàn)過表達Bcl2可以抑制成骨細胞分化，同時抑制骨細胞進程，誘導骨細胞凋亡，因此在OP發(fā)生過程中Bcl2發(fā)揮重要的作用。目前認為Bcl2作用于細胞主要通過這幾個方面：①Bcl2可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管中Ca2+的釋放[10]；②Bcl2 氧化還原機制，H2O2在 Bcl2半胱氨酸氧化作用中作為一個潛在的因素直接調(diào)節(jié)細胞凋亡[11]；③Bcl2與Bax的相互作用，與 Bax 形成異源二聚體，從而抑制細胞凋亡[12]；④Bcl2 可與胞外信號調(diào)節(jié)激酶 ERK1/2 形成Bcl2-ERK復合物而抑制細胞凋亡[13]。在凋亡家族中，過表達BCLXL可以抑制成骨細胞的凋亡，增加骨量和骨強度[14]，在Bcl2(-/-)小鼠中Bcl2可能抑制破骨細胞進而增加骨量[15]，近期研究[16]發(fā)現(xiàn)高重力(20 g)不僅可抑制成骨細胞增殖，促進細胞凋亡，還可導致成骨細胞發(fā)生變性壞死，但適當濃度(10μg/L)的淫羊藿苷可逆轉高重力加載所導致的不利影響，對成骨細胞起相應的保護作用。

BMP-2是轉化生長因子β超家族的重要成員，具有促骨形成和異位成骨的生物特征，BMPs是經(jīng)典BMPs/Smad通路的重要配體[17]，也可以直接通過Wnt/β-catenin通路增加Wntl、LEF/TCFs等蛋白的表達[18]；OPG是破骨細胞中OPG-RANKL-RANK的重要通路蛋白，成骨細胞分泌OPG與RANK競爭性結合 RANKL，阻止RANKL 與RANK之間的結合，抑制OC 的分化[19, 20]。本實驗結果顯示，在成骨細胞UMR-106細胞中，腺病毒沉默Bcl2后，與空載腺病毒比較，可以降低BMP-2、OPG的蛋白的表達，但是OPG mRNA基因未見明顯變化；過表達Bcl2腺病毒與空載腺病毒比較，過表達Bcl2可以增加BMP-2、OPG蛋白的表達，在Moriishi等研究中，過表達Bcl2對原代成骨細胞基因OPG沒有影響[2]，在本實驗中過表達Bcl2可以提高OPG蛋白的表達，兩者的實驗對象不同，Moriishi等用的是原代成骨細胞，檢測mRNA，而本次實驗用的是UMR-106細胞，檢測蛋白；在沉默和過表達Bcl2腺病毒中，OPG mRNA表達未見明顯變化，其具體的作用機制有待進一步研究；中藥干預細胞后，可以提高沉默腺病毒引起的BMP-2、OPG的蛋白表達，但是在過表達Bcl2基因中，中藥對BMP-2、OPG蛋白未見明顯作用，可能中藥作用于UMR-106細胞與Bcl2的蛋白表達量有關。

綜上所述，沉默Bcl2可以抑制BMP-2、OPG蛋白的表達，OPG mRNA無明顯變化，過表達Bcl2可以促進BMP-2、OPG蛋白的表達，沉默Bcl2基因，補腎健脾活血方上調(diào)成骨相關蛋白BMP-2、OPG蛋白的表達，但是在過表達Bcl2的細胞中，中藥沒有提高BMP-2、OPG蛋白的表達，補腎健脾活血方可能通過凋亡蛋白促進成骨相關蛋白BMP-2、OPG蛋白的表達，發(fā)揮保護UMR-106細胞的成骨分化，進而防治OP的發(fā)生，但在此過程中是否有其他凋亡蛋白的參與，以及是否發(fā)生了級聯(lián)反應，有待進一步深入研究。