阿托伐他汀鈣對成骨前體細胞(3T3-E1)增殖與分化的影響及其與內質網應激的聯系

王青 羅歡 徐麗麗 王賓 劉煥娜 楊乃龍

青島大學醫學院附屬醫院內分泌科，山東 青島 266003

他汀類藥物(statins)在臨床上多用于高脂血癥及心腦血管疾病的治療，此前有研究表明，他汀類藥物能促進骨形態發生蛋白2(BMP-2)的表達，修復骨微細結構，對骨代謝有一定影響[1]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指當機體處于缺血缺氧、氧化應激、功能蛋白基因突變、鈣離子失衡、脂質合成紊亂等情況下，內質網失去正常的生理功能，通過一系列信號轉導通路引起細胞內的保護性應答反應，是細胞的適應性調節過程[2]。近幾年研究表明，內質網應激信號通路可能參與骨質疏松癥的發生，從不同途徑影響骨代謝平衡，但其具體機制仍未明確，與骨質疏松的關系需要進一步研究。本實驗擬研究阿托伐他汀鈣對3T3-E1細胞增殖及分化的影響，進一步探討該過程與內質網應激通路相關基因表達的關系，為骨質疏松的臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

3T3-E1細胞(由中科院上海細胞庫提供)；α-DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗(美國Hyclone公司)；TRIZOL(美國Gibco公司)；Cell Counting Kit-8細胞增殖/毒性檢測>試劑盒、堿性磷酸酶染色試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(北京天根生化科技公司)；引物(上海生物工程技術服務有限公司)；阿托伐他汀鈣(輝瑞制藥有限公司，商品名：立普妥)。

1.2 實驗方法

1.2.13T3-E1細胞的培養：將-80 ℃冰箱凍存的細胞立即投入37～40 ℃水浴箱，水中晃動直至凍存液全部融化。細胞懸液移入離心管內，加培養液5 mL并吹打混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清，細胞沉淀里加10%FBS的α-DMEM5 mL，輕輕混合均勻后接種于培養瓶內，放置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱，每兩天換液一次，當細胞匯合至80%左右時傳代進行實驗。

1.2.2CCK-8比色法測定阿托伐他汀鈣對細胞增殖的影響：細胞懸液以1×105/mL密度接種到96孔無菌細胞培養板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h，待細胞貼壁生長后，加入含不同濃度阿托伐他鈣0 mol/L(對照組)、10-8、10-7、10-6mol/L的培養液繼續培養細胞，每組設置5個復孔，作用24 h分別于每孔加10 μLCCK-8試劑，37 ℃、5%CO2培養箱繼續孵育2 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值(OD值)。

1.2.3堿性磷酸酶活性檢測：成骨細胞懸液以1×105/mL密度接種到96孔無菌細胞培養板，測定孔加入0 mol/L(對照組)、10-8、10-7、10-6mol/L阿托伐他汀鈣處理24 h后的上清液5 μL，測定孔均設置2個復孔。按堿性磷酸酶試劑盒步驟加入同比例的緩沖液和基質液，充分混合均勻，37 ℃水溶15 min，加入150 μL顯色劑，輕輕振搖孔板混勻，于波長520 nm處測定各孔吸光度(OD值)。

1.2.4RT-PCR法檢測成骨細胞Bip、PERK、Eif2a基因的相對表達水平：向細胞中加入終濃度10-6mol/L阿托伐他汀鈣干預細胞24 h，用Trizol法提取細胞樣本中總RNA。RNA定量后按照試劑盒說明反轉錄成第一鏈cDNA，進行PCR反應。PCR反應體系：總體積20 μL，包括：2*SuperReal PreMix Plus10 μL，上游、下游引物各0.6 μL，Cdna 2 μL，50*ROX Reference Dye0.4 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL補足至20 μL。PCR反應條件：95℃15 min，95℃10 s，58℃30 s，72℃30 s，40個循環。基因引物及序列見表1，應用熔解度曲線法鑒定產物的片段大小與特異性，根據擴增產物的Ct值與相對標準曲線得出各標本所含基因的模板量，mRNA的相對表達量以公式2-△△Ct計算。

表1 基因序列及其引物Table 1 The sequence of gene primers

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 3T3-E1細胞形態學觀察

復蘇培養24 h后細胞呈現貼壁生長，胞質豐富，生長狀態良好，形態近似為梭形、多角形等。如圖1。

2.2 阿托伐他汀鈣對3T3-E1細胞增殖和ALP活性的影響

不同濃度的阿托伐他汀鈣(0、10-8、10-7、10-6mol/L) 作用于細胞24 h后，與對照組比較，各組的3T3-E1細胞OD值及ALP活性均增加，且以高濃度組的阿托伐他汀鈣(10-6mol/L)增加最明顯(P<0.05)，對照組與實驗組、實驗各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度阿托伐他汀鈣對3T3-E1細胞增殖和ALP活性的影響Table 2 Effects of atorvastatin calcium with different concentrations on proliferation and ALP activity of 3T3-E1 cells

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001; 實驗組間比較，P<0.05

圖1 3T3-E1細胞形態觀察(×100)注:箭頭()所指為典型的梭形成骨前體細胞(3T3-E1細胞)Fig.1 Morphology of 3T3-E1 cell(×100)

2.3 阿托伐他汀鈣對3T3-E1細胞Bip、PERK、Eif2a基因表達的影響

選取對細胞增殖及分化能力作用最佳的10-6mol/L的阿托伐他汀鈣干預3T3-E1細胞24 h，RT-PCR結果顯示，3T3-E1細胞Bip、PERK、eIF2α基因mRNA表達均高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 阿托伐他汀鈣(10-6 mol/L)對3T3-E1細胞Bip、PERK、Eif2a基因表達的影響

注：與對照組(0 mol/L)相比，*P<0.05

3 討論

骨質疏松癥(osteoporosis,OP) 是以低骨量、骨組織微結構破壞為特征，引起骨質脆性增加和易于發生骨折的全身性代謝性疾病。目前中國60歲以上人口>2.1億，65歲以上人口>1.4億，已居全球老年人口絕對數最高[3]。他汀類藥物屬于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(MG-CoA)還原酶抑制劑，可以減少肝內膽固醇的生物合成，降低血清膽固醇濃度，是臨床最常用的調脂藥物之一[4]。數年前Mundy等[5]最早發現他汀類藥物可激活成骨細胞，誘導骨形態發生蛋白2(BMP-2)基因表達，刺激骨形成。動物研究表明，他汀類藥物能夠介導堿性磷酸酶活性的增強，以及促進骨形態發生蛋白-2、血管上皮生長因子和骨鈣素在成骨細胞中的表達，促進來自小鼠顱蓋骨的3T3-E1細胞的成骨細胞分化和礦化[6]。他汀類藥物的合成代謝作用，類似于飲食所賦予的具有抗破骨細胞活性和骨保護活性的類異戊二烯，具有HMG CoA還原酶抑制活性的生育三烯酚，它們能夠促進成骨細胞生成，抑制破骨細胞分化并誘導破骨細胞凋亡，這些作用提示他汀類藥物作為3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，可能與骨代謝有關[7]。Meier[8]、Wang等[9]多項回顧性分析與調查結果顯示，他汀類藥物能恢復骨骼細微結構，增加骨密度、降低骨折風險。Meta分析結果亦有顯示，他汀類藥物能夠提高糖尿病合并骨質疏松癥患者的腰椎、Ward三角區、GBP骨密度，但對股骨頸、大轉子、及粗隆的骨密度提高不明顯。對于糖尿病合并骨質疏松癥的患者，雖然他汀類藥物在實際臨床工作中應用的整體療效不是很理想，但此為今后的關于他汀類藥物作為一種調脂藥物是否能夠應用于骨質疏松領域提供了參考[10]。他汀類藥物可謂是一種具有潛力的促進骨形成藥物。

內質網是真核細胞重要的膜性細胞器，主要負責蛋白的合成、修飾與加工、調節細胞內外鈣離子穩態。各種應激能夠破壞內質網的內環境穩態，引起內質網內非折疊蛋白與錯誤折疊的蛋白過度蓄積，由此引發未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)[11,12]，UPR的出現可能提示內質網應激的發生。UPR是由內質網分子伴侶GRP78/BIP(glucose-regulated protein78/immunoglobulin binding protein，GRP78/BiP)與PERK、IRE-1、ATF6 3個感受蛋白介導，生理狀態下，GRP78/BiP與PERK、ATF6、IRE-1感受蛋白結合，處在無活性狀態。當內質網應激發生時，未折疊蛋白于內質網內堆積，導致GRP78/BiP從上述3種感受蛋白上解離，進而結合未折疊蛋白，解離后的感受蛋白被活化，并啟動UPR，減少未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網中的堆積，最終恢復內質網的正常生理功能[13,14]。

PERK是內質網膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，與GRP78/BiP解離后可以促進位于內質網外側的真核細胞蛋白質翻譯起始復合體2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，磷酸化之后的eIF2α能抑制大多數mRNA的翻譯，并減少蛋白質的合成，進而減輕內質網的加工負荷，利于恢復內質網穩態[15]。Zhang等[16,17]利用可阻止PERK下游的eIF2α去磷酸化的化合物Salubrinal進行體外實驗，揭示了由Salubrinal作用后增加的eIF2α磷酸化降低了小鼠骨髓細胞中破骨細胞分化，通過PERK-eIF2α-ATF4信號通路增強成骨細胞分化，首次報道了通過增加eIF2α磷酸化發揮抗骨質疏松活性。Hamamura等[18]研究表明，內質網應激通過調節ATF4/CHOP信號通路進而增強成骨細胞的生長與分化能力。這些實驗研究發現，骨質疏松癥的發生與骨骼發育可能和內質網應激相關，推測內質網應激可能成為骨骼疾病的治療靶點[19,20]。

本試驗通過體外給予不同濃度的阿托伐他汀鈣干預培養3T3-E1細胞，24 h后觀察到阿托伐他汀鈣可促進細胞增殖、增加細胞ALP活性，在10-6mol/L作用最顯著。以終濃度10-6mol/L阿托伐他汀鈣干預細胞，RT-PCR法觀察Bip、PERK、Eif2a基因表達均相對增加。

綜上所述，該體外實驗所選擇的藥物濃度及作用時間下，利于成骨細胞增殖，可促進內質網應激信號通路的標志性基因Bip、PERK、Eif2a的表達，推測阿托伐他汀鈣發揮骨保護作用的機制可能與Bip-PERK-Eif2a等信號通路有關，但內質網應激作為有效靶點參與骨質疏松的機制尚需進一步證實。目前多數研究局限于體外細胞實驗，人體實驗缺少循證醫學證據，缺乏多中心、大樣本、前瞻性的規范性研究，且他汀類藥物主要通過肝腎代謝，如何提高他汀類藥物對靶組織的作用以促進藥物吸收、發揮促骨形成作用還有待研究[21]。