中藥復(fù)方鹿角膠丸通過(guò)PI3-K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞凋亡

于冬冬 趙丹陽(yáng) 姚嘯生

1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 1100322. 沈陽(yáng)市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110032

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏癥(GIOP)是臨床的常見病、多發(fā)病，其發(fā)病機(jī)制目前還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，GIOP中破骨細(xì)胞的凋亡受到抑制[1]。

中醫(yī)理論認(rèn)為“補(bǔ)腎填精壯骨法”是治療骨質(zhì)疏松癥根本治法，其中《太平圣惠方》中的“鹿角膠丸”具有促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收[2]、防治骨質(zhì)疏松癥之功效[3]。同時(shí)，本研究者在臨床工作中使用中藥復(fù)方鹿角膠治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥患者，收獲很好的臨床療效。

因此，本研究在中醫(yī)理論的基礎(chǔ)上，從破骨細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制入手，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，研究中藥方劑鹿角膠丸能否調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞凋亡，為其臨床防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1. 1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞：SPF級(jí)SD雌性大鼠24只，體質(zhì)量 300± 10 g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組各6只，以制備含藥血清，大鼠均由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供(許可證號(hào) SCXK(遼)2015-0001)。

1.1.2藥物及試劑：本實(shí)驗(yàn)中藥飲片均在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院購(gòu)買。中藥復(fù)方鹿角膠丸組成：由鹿角膠3 g，附子10 g，肉桂5 g，杜仲10 g，山茱萸10 g，菟絲子12 g，熟地黃10 g，肉蓯蓉10 g，五味子5 g，牛膝10 g，巴戟天5 g。將藥制備為水煎劑，生藥量為1 g/mL。

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞(ATCC，美國(guó))，sRANKL(Peprotech，美國(guó))，M-CSF(Peprotech，美國(guó))，DMEM(Hychone，美國(guó))，進(jìn)口胎牛血清(Hychone，美國(guó))，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國(guó))，Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、p-AKT、T-AKT(CTS，美國(guó))，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(CTS，美國(guó))。

1.1.3儀器：細(xì)胞孵箱(Thermo，美國(guó))；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))；AMR-100酶標(biāo)儀(杭州奧盛儀器有限公司，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1含藥血清制備與實(shí)驗(yàn)分組：24只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、中藥復(fù)方鹿角膠丸(LJJW高、中、低)組，6只/組。以每 kg體重大鼠的給藥量為正常人給藥量 6. 3倍，每次大鼠給藥量以正常人給藥量的LJJW高(3倍等效量)、LJJW中(等效量)、LJJW低(1/3等效量)倍計(jì)算，計(jì)算后為7.29、2.43、0.81 g/kg體重，LJJW高濃度組加水煎致4 mL液體量，其他組根據(jù)比例進(jìn)行稀釋，每日灌服2次，每次灌服2 mL，空白對(duì)照組灌服等體積的蒸餾水。第4天早晨給藥2 h后麻醉，腹主動(dòng)脈取血后靜置2 h，離心(2 500 r/min，4 ℃，20 min)后收集血清，56 ℃浴滅活30 min后分裝，-86 ℃保存。

1.2.2小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW 264.7培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化：未分化的小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW 264.7，培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，不含抗生素，37 ℃，5%CO2)。細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度1×104/孔，24 h后換成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液培(DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、20ng/mL RANKL、20ng/mL M-CSF)繼續(xù)培養(yǎng)5 d。

1.2.3MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：細(xì)胞分對(duì)照(Control)、鹿角膠丸高、中、低濃度組(LJJW高、中、低)。細(xì)胞平鋪(5×103細(xì)胞/孔)96孔平板中，24 h后更換分化培養(yǎng)基(藥物處理組的血清終濃度為15%)，細(xì)胞經(jīng)處理3、12、24、48、72 h后，每孔加20 μL CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent。在37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。490 nm讀取吸光度值。OD值=(處理后細(xì)胞OD值-對(duì)照組細(xì)胞OD值/N)，n>3。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)：細(xì)胞分Control、LJJW(中)、LY294002、LJJW(中)+LY294002組。收取細(xì)胞后PBS洗滌，細(xì)胞重懸于195 μL結(jié)合緩沖液。避光與5 μL Annexin V FITC和PI 10 μL 在25℃孵育15 min。孵育后加入300 μL結(jié)合緩沖液進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析n>3。

1.2.5Western Blot檢測(cè)：細(xì)胞分Control、LJJW、LY294002、LJJW+LY294002組。細(xì)胞加入裂解液提取蛋白，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白樣品，于10%聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后100 V電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。37 ℃封閉1 h、一抗4 ℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的稀釋二抗孵育，ECL發(fā)光法曝光成像，掃描入電腦，n>3。Image J軟件測(cè)定平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 鹿角膠丸抑制破骨細(xì)胞增殖活性

MTS方法對(duì)破骨細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測(cè)(圖1)，結(jié)果顯示，各個(gè)濃度的鹿角膠丸(LJJW高、中、低)均能抑制破骨細(xì)胞的增殖活性(P<0.05，與對(duì)照組相比較)，其中以LJJW(中濃度)作用24 h后具有較大的增殖活性抑制作用。因此LJJW(中濃度)及24 h作為實(shí)驗(yàn)用藥濃度及作用時(shí)間。

圖1 鹿角膠丸抑制破骨細(xì)胞增殖Fig.1 Antler pill inhibited proliferation of osteoclasts

圖3 鹿角膠丸促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡Fig.3 Antler pill promoted apoptosis of osteoclasts

2.2 破骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(圖2)，對(duì)照組的破骨細(xì)胞呈圓形，透光度好，邊界清晰，無(wú)觸角，貼于培養(yǎng)瓶底部。加入鹿角膠丸后，細(xì)胞明顯老化，可見觸角，細(xì)胞略呈短梭形，細(xì)胞透光度下降，緊密貼附于瓶底，凋亡細(xì)胞皺縮，漂浮于培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞融合，最后形成巨大的多核破骨細(xì)胞。

圖2 形態(tài)學(xué)觀察鹿角膠丸促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡Fig.2 Morphological observation of osteoclast apoptosis promoted by antler pill

2.3 LJJW通過(guò)PI3K/AKT通路抑制破骨細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示鹿角膠丸促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡(圖3)，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為1.20%±0.05%，加入鹿角膠丸后破骨細(xì)胞的凋亡增加達(dá)8.50%±0.15%(P<0.01，與對(duì)照組相比較)，單獨(dú)加入PI3K/AKT抑制劑LY294002后對(duì)破骨細(xì)胞的凋亡影響不明顯1.00%±0.04%(P>0.05，與對(duì)照組相比較)，預(yù)處理LY294002，鹿角膠丸的促細(xì)胞凋亡作用受到抑制，細(xì)胞凋亡率為3.00%±0.16%(P<0.05，與對(duì)照組相比較)。

2.4 Westerm Blot結(jié)果

圖4 A 鹿角膠丸促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax、Caspase3表達(dá)Fig.4 A Antler pill promoted the expression of Bcl-2 and inhibited the expression of Bax and Caspase3

圖4 B 鹿角膠丸促進(jìn)AKT磷酸化Fig.4 B Antler pill promoted the phosphorylation of AKT

圖4 C 蛋白電泳量化圖Fig.4 C Quantitative electrophoresis of the protein

進(jìn)一步分析鹿角膠丸促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制(圖4 A、B、C)，免疫印跡結(jié)果顯示，鹿角膠丸促進(jìn)線粒體Bax表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Caspase-3的裂解(P>0.05，與對(duì)照組相比較)。同時(shí)通路蛋白顯示，鹿角膠丸促進(jìn)AKT磷酸化，加入PI3K/AKT通路抑制LY294002后AKT的磷酸化受到抑制，預(yù)處理LY294002后加入鹿角膠丸，鹿角膠丸的促AKT磷酸化作用被抑制(P>0.05，與對(duì)照組相比較)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)GIOP中成骨細(xì)胞分化受抑制、凋亡增加[4]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)葛根素抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡[5]。Shi等[1]發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素激活RANK-RANKL-OPG 系統(tǒng)，通過(guò)增加RANKL配體表達(dá)并減少OPG的表達(dá)，刺激破骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞的凋亡而導(dǎo)致骨吸收增加。因此，若應(yīng)用能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡的藥物，對(duì)于臨床防治GIOP具有重要的意義。

《太平圣惠方》中記載“鹿角膠丸”，由鹿角膠、附子、桂心、杜仲、山茱萸、菟絲子、熟地黃、肉蓯蓉、五味子、牛膝、巴戟天組成。功效益腎補(bǔ)骨。方用鹿角、菟絲子等溫腎壯陽(yáng)，熟地、附子滋陰填精，山茱萸、牛膝等，具有溫陽(yáng)益陰、強(qiáng)筋壯骨的作用，在溫補(bǔ)腎陽(yáng)的同時(shí)能健脾益氣、滋腎陰、養(yǎng)肝血，標(biāo)本兼治。動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，鹿角膠丸具有促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收的藥效學(xué)作用[2,3]，但具體的分子機(jī)制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥活性成分作用于破骨細(xì)胞，促進(jìn)其凋亡，如根皮素、柚皮苷等[6,7]。因此，我們從中藥鹿角膠丸調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞為切入點(diǎn)，探討其防治GIOP的潛在機(jī)制。

PI3-K/Akt通路作為細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，PI3-K/ Akt信號(hào)通路參與人破骨細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)[8]。線粒體是細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部位，能夠合成釋放一系列的抗凋亡及促凋亡因子，其中Bcl-2家族蛋白是抗細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子。Bcl-2能夠與Bax結(jié)合并抑制細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2-Bax復(fù)合體與破骨細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)密切相關(guān)[9]。我們研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方鹿角膠丸能夠通過(guò)PI3-K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，在調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞凋亡的過(guò)程中中藥復(fù)方鹿角膠丸通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2-Bax復(fù)合體，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax的表達(dá)，抑制Caspase3的裂解。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素為外源性“純陽(yáng)”之品。生理情況下，人體分泌生理劑量的糖皮質(zhì)激素主要參與人體的正常工作機(jī)制，以保證陽(yáng)氣發(fā)揮“陽(yáng)者衛(wèi)外而為固也”的作用，以維持臟腑各種生理功能。若大劑量糖皮質(zhì)激素使用日久，元陽(yáng)之氣如不敷出，過(guò)度外出而不潛降、內(nèi)入、收藏，窮必及腎，終致腎之“封藏”失司，耗傷腎陰，最終導(dǎo)致陰陽(yáng)俱虛。

目前研究骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理雖然較多，但是基于PI3-K/AKT信號(hào)通路，從破骨細(xì)胞凋亡作為研究的切入點(diǎn)，探索中醫(yī)藥對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制的相關(guān)研究較少。因此，本研究對(duì)于中醫(yī)藥臨床防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥有一定的意義。