川芎嗪對膝骨性關節炎大鼠軟骨VEGF表達的影響

李飛龍 謝平金,3 柴生颋* 劉治軍 陳群群 劉柄辰,3

1.廣州中醫藥大學第三附屬醫院骨科，廣東 廣州 5100002. 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 5104053. 廣州中醫藥大學嶺南醫學研究中心中醫骨傷科學實驗室，廣東 廣州 510405

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)作為膝關節軟骨變性、破壞及關節周圍骨質增生為特征的慢性關節病[1]，多見于60歲以上人群[2]，臨床上表現為膝關節局部疼痛、晨僵、腫脹、活動受限，嚴重者可出現關節的畸形。隨年齡增長而發生率明顯增加，是引起老年人關節疼痛和功能障礙的主要原因，并最終可導致殘疾的風險[3]。KOA的發病率目前正快速增長，故對于如何早期防治KOA已成為當前研究熱點。川芎嗪作為活血化瘀類中藥川芎中提取的一種有效活性生物堿，在治療KOA的臨床及實驗研究已有相關報道。本研究通過觀察川芎嗪對實驗性大鼠KOA關節軟骨組織學評分、VEGF表達水平的影響來探討其防治早期KOA的機制，為治療膝骨性關節炎提供有效途徑和應用依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物：健康3月齡雄性大鼠50只，體重180～220 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑：磷酸川芎嗪片(麗珠集團利民制藥廠，國藥準字：H44024348)；塞來昔布(輝瑞制藥有限公司，國藥準字J20140072)；木瓜蛋白酶(上海源葉科技有限公司S10011,CAS:9001-73-4)；石蠟(國藥化學試劑有限公司)；蘇木素伊紅染色試劑盒(北京雷根生物技術有限公司)；中強度RIPA裂解液(FD008；弗德生物)；蛋白酶抑制劑混合物(FD1001；弗德生物)；100 mmol/L PMSF(FD100；弗德生物)蛋白磷酸酶抑制劑混合物(FD1002；弗德生物)；BCA蛋白定量試劑盒(FD2001；弗德生物)；5×蛋白上樣緩沖液(AR1112；博士德)；預染蛋白Marker(Fermentas)；Tris-base(V900483；Vetec)；甘氨酸(G800880；Macklin)；過硫酸銨(A801035；Macklin)；SDS(Biosharp)；丙烯酰胺(0341-1 kg；Amresco)；N.N-甲叉雙丙烯酰胺(N813086-100 g；Macklin)；PVDF膜 0.45 μm(Millipore)；PVDF膜 0.22 μm(Millipore)；脫脂奶粉(232100；BD)；TWEEN 20(Biosharp)；顯影定影試劑(國產)TRIzol Reagent(DP424；天根)。

1.1.3主要設備：純水儀(重慶艾科浦)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；臺式高速離心機(SCIlogex)；磁力攪拌器(常州澳華儀器有限公司)；脫色搖床(北京六一儀器廠)；電泳儀(北京六一儀器廠)；水浴鍋(姜堰市天力醫療器械廠有限公司)；暗匣(廣東粵華醫療器械廠有限公司)；感光膠片(Kodak)；封口機PF(溫州市江南機械廠)；低溫冰箱(西門子)；掃描儀(Canon)；多功能酶標儀(上海現科儀器有限公司)；灰度分析軟件(Image J)。輪轉式石蠟切片機(德國Leica)。

1.1.4溶液配制：轉移緩沖液(2 L)：甘氨酸 28.8 g，Tris4.84 g， 甲醇400 mL，加去離子水定溶至2 000 mL；電泳緩沖液(2 L)：Tris 6.06 g，甘氨酸37.54 g，SDS 2 g，加去離子水定溶至2 000 mL；TBS緩沖液(1 L)：1 mol/L Tris-HCl(pH=7.5)10 mL NaCl 8.8 g 加去離子水定溶至1 000 mL；30%丙烯酰胺(1 L)：丙烯酰胺290 g，BIS 10 g，加去離子水充分溶解后定溶至1 000 mL；非磷酸化蛋白酶抑制劑：每1 mL RIPA試劑中加入5 μL蛋白酶抑制劑和10 μL 100 mM的PMSF，混勻；磷酸化蛋白酶抑制劑：每1 mL RIPA試劑中同時加入5 μL蛋白酶抑制劑、10 μL 100 mM的PMSF、5 μL磷酸化蛋白酶抑制劑，混勻。

1.2 方法

1.2.1分組與造模：將實驗動物依據隨機分配的原則分為正常組、模型對照組、高劑量組、低劑量組和陽性對照組。每組10只，除正常組外，均采用木瓜蛋白酶關節腔注射建立大鼠 KOA 模型。在無菌條件下用 0.9%NaCl溶液配4%(W/V)木瓜蛋白酶溶液，于4 ℃恒溫冰箱儲存，至實驗前 4 h 取出室溫放置。將大鼠腹腔注射 10%水合氯醛麻醉，麻醉成功后雙膝關節備皮、消毒、屈曲約 45°，從髕骨下緣前內側的膝眼向髁間窩方向進針，明顯有落空感后，針尖抵達股骨內側髁再回撤 2 mm，并注射木瓜蛋白酶，分別向雙側膝關節腔注入4%木瓜蛋白酶0.2 mL。每隔3 d注射1次，連續注射3次(即第1天、第4天、第7天注射)。注射后1周，觀察各組大鼠膝關節外觀，并在各組各取1只大鼠處死后，取關節軟骨行HE切片，驗證造模是否成功。

1.2.2干預方法：驗證造模成功后開始灌胃給藥治療，高劑量組、低劑量組按人和動物間體表面積折算的等效劑量比值計算，分別給予灌胃磷酸川芎嗪片TMP 100 和50 mg/kg(分別相當于臨床用藥量的 20 和 10 倍)，每天用藥 1 次；陽性對照組灌服塞來昔布劑量為 24 mg/kg，每日定時給藥1次，正常組、模型組灌服等量的生理鹽水，每天1次，連續灌胃 6 周后處死，右膝脛骨平臺行組織切片觀察，左膝取軟骨組織進行Western Blot蛋白檢測。所有SD大鼠均喂養在恒溫、恒濕的清潔環境中，環境溫度為(25±1)℃，濕度為68%，每天12 h 光照/黑暗，任意進食飼養者提供的大鼠標準飼料和自來水。

1.2.3檢測指標：①大體形態及切片染色觀察。治療結束后，遵循安樂死的原則將各組實驗鼠處死，解剖各組實驗鼠雙側膝關節并暴露關節軟骨，肉眼觀察關節軟骨光滑度、色澤、表面是否有糜爛及潰瘍、是否有纖維性增生及邊緣是否有骨贅形成等。右側膝關節脛骨平臺經4%多聚甲醛4 ℃固定、脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋，制作成石蠟標本，行4～6 μm 厚切片。HE染色后在光鏡下觀察各組切片染色情況，采用改良Mankin法[4]對軟骨組織結構、細胞、染色以及潮線的完整性評分，評分越高說明軟骨退變越嚴重。②Western Blot檢測。取左側膝關節脛骨平臺關節軟骨組織-80 ℃保存備用，并根據說明書配制全蛋白提取液，將軟骨組織置于全蛋白提取液中，利用勻漿器于冰上破碎軟骨組織。勻漿后，采用Braford 比色法測定樣品蛋白濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(5∶1)，100 ℃煮沸5 min。-20 ℃保存備用。分別至于濃縮膠和分離膠中電泳，350mA轉膜70 min。37封閉液中封閉1 h；將PVDF膜分別放入裝有3 mL稀釋后的VEGF抗體(稀釋比例1∶1 000，轉膜條件：300 mA恒流轉膜30 min，廠家：Abcam，貨號：Ab46154)，25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次5 min；將PVDF膜放入含有3 mL辣根過氧化物酶標記的稀釋二抗溶液的小槽內，置于搖床上室溫平緩搖動40 min(二抗：HRP Goat anti-Rabbit IgG(廠家：BOSTER，貨號：BA1054，稀釋比例：1∶20 000，孵育條件：室溫孵育40 min)25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次7 min；用化學發光顯色后進行圖像分析，經軟件分析，以VEGF/β-actin比值表示VEGF蛋白表達水平。

1.3 統計學處理

應用SPSS19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據以均數±標準差表示。若數據呈正態分布且方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗；若數據呈正態分布但方差不齊，多組間比較采用Welch法和Brown-Forsythe法，多重比較采用Dunnett T3檢驗；以P<0.05為差異有顯著性意義。Western Blot檢測及PCR 結果采用 GraphPad Prism 5軟件進行數據分析，組間比較采用雙尾t檢驗。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 軟骨組織學觀察

實驗結束后，除正常組外，各組均出現不同程度的軟骨損傷，主要以股骨內踝及內側脛骨平臺顯著。如表1及圖1示，各組軟骨Mankin評分中，川芎嗪各劑量組和陽性對照組均高于正常組、且均低于模型組(P<0.05)，而陽性對照組評分低于川芎嗪低劑量組，但高于川芎嗪高劑量組(P<0.05)。

表1 實驗結束后軟骨組織Mankin評分

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與陽性對照組比較，#P<0.05

2.2 Western Blot檢測軟骨組織VEGF蛋白表達結果

如圖2、圖3 所示，正常組、川芎嗪各劑量組及陽性對照組中軟骨VEGF相對表達量均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，川芎嗪高劑量組VEGF表達量明顯低于陽性對照組(P<0.05)、而川芎嗪低劑量組其表達則高于陽性對照組(P<0.05)。

圖1 各組HE染色切片Fig.1 HE staining results of cartilage tissue in rats of each group

圖2 各組大鼠軟骨組織VEGF 的表達水平注：與模型組比較，*P<0.05；與陽性對照組比較，△P<0.05Fig.2 The expression level of VEGF in the cartilage of rats in different experimental groups

圖3 各組軟骨VEGF表達凝膠電泳圖Fig.3 The electrophoresis chart of VEGF expression in the cartilaginous of rats in different experimental groups

3 討論

中醫認為KOA屬于“膝痹病”、“骨痹”、“痹證”等范疇，并以肝腎虧虛為本、瘀血阻滯為標，而發病早期以瘀血阻滯為關鍵病機。根據傳統中醫理論，結合臨床體會，我們認為治療上早期活血化瘀、是防治KOA發病的重要環節。中藥川芎，歸肝、膽、心經，具有活血化瘀行氣，祛風止痛功效。《本草綱目》云“川芎，血中氣藥也。肝苦急，以辛補之，故血虛者宜之。辛以散之，故氣郁者宜之”。川芎嗪(四甲基毗嗪，ligustrazine)是從中藥川芎中提取的一種有效活性生物堿，近年相關研究發現，具有改善關節內微循環，降低骨內壓作用，保護和修復早期OA關節軟骨[5,6]；其能夠抑制基質降解，抑制細胞凋亡[7]；減輕關節軟骨退變程度，并可促進軟骨的自身修復[8]。本課題組前期研究亦發現川芎嗪能明顯降低骨關節炎關節液中NO、PGE2的水平，對減輕OA炎癥有一定的作用[10]。本研究通過木瓜蛋白酶關節腔注射作為誘導大鼠膝早期骨關節炎的方法，已廣泛用于研究[11,12]。本實驗采用木瓜蛋白酶溶液關節腔注射制作大鼠KOA模型，并干預6周后行HE染色切片軟骨Mankin評分，Mankin評分越高，說明軟骨損傷程度越嚴重。其中正常組<川芎嗪高劑量組<陽性對照組<川芎嗪低劑量組<模型組低(P<0.05)。這充分說明，川芎嗪能減輕關節軟骨退變且適當提高血藥濃度能更好的減輕關節軟骨退變程度。

正常的關節軟骨內促血管生成因子與抗血管生成因子處于動態平衡，不存在血管分布。而在OA情況下，骨/軟骨結合處及滑膜中血管生成明顯增多[13]，而其中VEGF直接或間接的參與了血管新生的每一個環節[14]。因感覺神經隨著新生血管長入關節，血管新生既導致結構的破壞，還導致疼痛的發生[15,16]。有研究表明，VEGF在OA中不僅能誘導血管生成，促進軟骨血管侵襲，還有可能參與軟骨退化及軟骨下骨硬化的病變[17-19]。 Jansen等[20]研究發現，VEGF可能參與了 OA 的早期改變，并且隨著軟骨破壞的級別越高，VEGF 的表達越高。Pfander等[21]表明，關節腔內氧張力明顯較低，并且與 OA 的嚴重程度成負相關。Hirohata、Atawia等[22,23]研究表明，VEGF是促進血管生成的重要因子，在低氧環境下表達增高。血管生成和炎癥在OA進程中緊密結合，炎癥可以刺激血管生成，血管生成所致的壓迫力和缺氧可以促進炎癥，也可以促進軟骨細胞肥大和軟骨內骨化，影響到疾病的發展和疼痛[24]。本實驗研究發現、川芎嗪各劑量組及陽性對照組中軟骨VEGF相對表達量均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；與陽性對照組相比，川芎嗪高劑量組VEGF表達量明顯低于陽性對照組(P<0.05)、而川芎嗪低劑量組其表達則均高于陽性對照組。這表明適當提高川芎嗪血藥濃度，可能通過下調VEGF的表達，從而減少軟骨血管侵襲，降低炎癥反應，這可能是在某種程度上減輕關節軟骨退變、修復軟骨損傷作用的機制之一。但VEGF表達下調后能否進一步激活軟骨細胞特異性的下游靶基因、實現的具體途徑如何，還有待進一步的研究。下一階段將重點研究川芎嗪含藥血清調節軟骨細胞的分子機制，為川芎嗪在防治OA方面，提供新的科學依據和實驗方法。