溶栓前A2b受體水平與腦缺血出血轉(zhuǎn)化的關(guān)系研究

雷明

缺血性腦卒中(ischemic stroke)是一種致死率和致殘率均較高的腦血管疾病，產(chǎn)生的原因主要是因腦血管發(fā)生閉塞導(dǎo)致腦組織缺血性損傷，發(fā)生急性腦卒中時(shí)應(yīng)盡早開通阻塞血管、挽救缺血半暗帶，恢復(fù)腦組織血流供應(yīng)，減輕因缺血造成的神經(jīng)功能損害[1]。目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的發(fā)病4.5 h內(nèi)使用重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator, rtPA)進(jìn)行靜脈溶栓治療能有效降低致殘率，但是出血轉(zhuǎn)化是靜脈rtPA溶栓治療后最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥，部分患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重致殘甚至死亡，嚴(yán)重影響溶栓治療的安全性和臨床療效，導(dǎo)致臨床溶栓治療率不足5%，嚴(yán)重制約了靜脈溶栓治療的臨床應(yīng)用[2-3]。因此，尋找有效預(yù)測(cè)腦缺血溶栓治療后出血轉(zhuǎn)化的指標(biāo)對(duì)提高靜脈溶栓治療的安全性和有效性具有重要的臨床價(jià)值。有研究顯示腺苷受體在腦缺血中具有重要生物效應(yīng)[4]，本研究旨在探討腺苷A2b受體對(duì)腦缺血溶栓治療后出血轉(zhuǎn)化的預(yù)測(cè)價(jià)值，為臨床提高靜脈溶栓治療的安全性和有效性提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

所有入選對(duì)象為2015年1月-2017年3月就診于本院的缺血性腦卒中患者83例，其中男53例，女30例，年齡63～75歲，平均年齡(65.2±6.3)歲，所有入選患者在其家屬簽訂書面知情同意的基礎(chǔ)上經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后開展本研究。入院開始治療前按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale, NIHSS)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)。入選標(biāo)準(zhǔn)：所有病例符合中國(guó)急性缺血性腦血管疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)2010版，發(fā)病在3 h以內(nèi)，經(jīng)頭顱CT和MRI確認(rèn)存在血管閉塞或狹窄同時(shí)排除顱內(nèi)出血，存在腦功能受損的體征超過1 h，且均經(jīng)溶栓治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡<18歲者，既往有顱內(nèi)出血史、腦梗死史、心肌梗死史，近半年內(nèi)有頭顱外傷史，患有肝腎等重要內(nèi)臟惡性腫瘤者，妊娠期女性，入院24 h內(nèi)死亡者，不能耐受靜脈rtPA溶栓治療者。

1.2 腺苷A2b受體mRNA水平的檢測(cè)

采用RT-PCR法進(jìn)行腺苷A2b受體mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，抽取患者靜脈血6 mL，經(jīng)肝素抗凝后用Ficoll-Hypague淋巴細(xì)胞分離液獲取單個(gè)核細(xì)胞，然后加RPMI-1640培養(yǎng)液于室溫下培養(yǎng)15 h(5%CO2)，利用Trizol試劑提取總RNA后取1 μg，添加dT15(0.5 μg)、dNTPs(1mmol/L)、rRNasin(20U)、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U)至總體積25 μl，40 ℃進(jìn)行1 h，然后92 ℃進(jìn)行10 min。按上游5’-TTCTACGGCTGCCTCTTCCTCG-3’，下游5’-GCACTGTCTTTACTGTTCCACC-3’;上游5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’，下游5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’分別合成腺苷A2b受體和內(nèi)參照GAPDH的引物，分別作227 bp、598 bp片段擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件為92 ℃變性2 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32次循環(huán)后取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行電泳(1.8%瓊脂糖凝膠)，利用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描計(jì)算相對(duì)比值。

1.3 溶栓治療

根據(jù)《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2014》[5]的要求，所有患者在起病4.5 h內(nèi)靜脈給予rtPA(商品名為愛通立，德國(guó)勃林格英格翰公司生產(chǎn))進(jìn)行溶栓治療，規(guī)格為20 mg/支，干粉制劑，按體質(zhì)量的0.9 mg/kg給藥，最大劑量為90 mg，最初1 min內(nèi)靜脈推注10%的劑量，剩余劑量持續(xù)靜脈微泵注入1 h。

1.4 出血轉(zhuǎn)化的評(píng)價(jià)及分組

患者經(jīng)溶栓治療后24 h內(nèi)進(jìn)行頭顱CT和MRI復(fù)查，與治療前相比新發(fā)現(xiàn)有高密度(CT)、低信號(hào)(MRI)病灶，則認(rèn)為是發(fā)生出血轉(zhuǎn)化，并分為HT組和非HT組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料組間比較使用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較使用t檢驗(yàn)，以P<0.05示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用多因素非條件Logistic回歸分析急性腦缺血患者經(jīng)靜脈溶栓治療后發(fā)生HT的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2 結(jié) 果

2.1 出血轉(zhuǎn)化組與非出血轉(zhuǎn)化組患者一般臨床資料比較

經(jīng)靜脈溶栓治療后發(fā)生HT者有36例，占43.4%。比較HT組和非HT組患者入院時(shí)的臨床資料顯示，2組患者在年齡、性別比例、吸煙史、TC、HDL-C、NIHSS評(píng)分均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但2組患者在高血壓病、糖尿病方面存在明顯差異，HT組高于非HT組(P<0.05)(表1)。

表1 HT組與非HT組患者一般臨床資料比較

2.2 ROC曲線分析腺苷A2b受體在腦缺血溶栓治療后發(fā)生HT的預(yù)測(cè)價(jià)值

以是否發(fā)生HT為狀態(tài)變量，作腺苷A2b受體mRNA表達(dá)的ROC曲線，分析預(yù)測(cè)腦缺血患者經(jīng)靜脈溶栓治療后發(fā)生HT的預(yù)測(cè)值為0.63，此時(shí)AUC=0.716，95%CI=0.628～0.837，P<0.001，敏感度71.3%，特異度為80.4%(圖1)。

圖1 腺苷A2b受體對(duì)溶栓后發(fā)生HT的診斷價(jià)值

2.3 logistic回歸分析經(jīng)溶栓治療后發(fā)生HT的危險(xiǎn)因素

將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量進(jìn)行多因素非條件logistic回歸分析顯示，腺苷A2b受體和高血壓病是經(jīng)溶栓治療后發(fā)生HT的危險(xiǎn)因素，而糖尿病不是經(jīng)溶栓治療后發(fā)生HT的危險(xiǎn)因素。

表2 logistic回歸分析經(jīng)溶栓治療后發(fā)生HT的危險(xiǎn)因素

2.4 經(jīng)溶栓治療后HT組與非HT組NIHSS評(píng)分比較

在經(jīng)溶栓治療后HT組與非HT組中每組再分為腺苷A2b受體>0.63組和腺苷A2b受體<0.63組，HT組NIHSS評(píng)分高于非HT組，同時(shí)HT組中腺苷A2b受體>0.63組的NIHSS評(píng)分最高，非HT組中腺苷A2b受體<0.63組的NIHSS評(píng)分最低。

表3 經(jīng)溶栓治療后HT組與非HT組NIHSS評(píng)分比較，分)

3 討 論

腺苷是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，當(dāng)腦組織受損時(shí)其局部濃度增大與相應(yīng)的受體結(jié)合，腺苷受體為G蛋白偶聯(lián)受體家族[6]。有研究顯示腺苷受體在腦缺血過程中具有神經(jīng)保護(hù)作用，而腺苷A2b受體是與腺苷親和力最低的1個(gè)受體[7-8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示發(fā)生腦缺血時(shí)腺苷A2b受體被激活，其蛋白表達(dá)水平上調(diào)，cAMP釋放增加，從而加速糖原分解，增大神經(jīng)元的能量供應(yīng)，起到神經(jīng)保護(hù)的作用[9]。當(dāng)患者發(fā)生腦卒中局部腦組織缺血缺氧時(shí)主要分布在海馬的腺苷A2b受體則被激活，可能參與抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)[10]。

本研究結(jié)果顯示，HT組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞腺苷A2b受體mRNA的表達(dá)水平明顯高于非HT組，利用ROC曲線分析腺苷A2b受體mRNA表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)腦缺血患者經(jīng)靜脈溶栓治療后發(fā)生HT具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值(AUC=0.716，95%CI=0.628～0.837，P<0.001，敏感度為71.3%，特異度為80.4%)，診斷臨界值為0.63，說明當(dāng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞腺苷A2b受體mRNA的表達(dá)水平高于0.63時(shí)，應(yīng)注意密切關(guān)注患者頭顱CT和MRI檢查，必要時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察甚至再手術(shù)，及時(shí)調(diào)整治療藥物，降低患者發(fā)生HT的風(fēng)險(xiǎn)，以期提高患者治療的療效。經(jīng)多因素非條件Logistic回歸分析顯示，腺苷A2b受體表達(dá)水平是腦缺血患者經(jīng)溶栓治療后發(fā)生HT的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=0.916，95%CI=0.899～0.969，P=0.032)，高血壓病也是經(jīng)溶栓治療后發(fā)生HT的危險(xiǎn)因素，但糖尿病不是經(jīng)溶栓治療后發(fā)生HT的危險(xiǎn)因素。經(jīng)過溶栓治療后評(píng)價(jià)各組的NIHSS評(píng)分顯示，HT組中腺苷A2b受體>0.63組的NIHSS評(píng)分最高，非HT組中腺苷A2b受體<0.63組的NIHSS評(píng)分最低。

本研究過程中存在一定的局限性，首先患者經(jīng)溶栓治療后24 h內(nèi)進(jìn)行頭顱CT和MRI復(fù)查判斷有無HT的發(fā)生，而CT和MRI的檢查仍然有可能會(huì)存在一定的漏診情況，不能確保100%準(zhǔn)確率，在后期的進(jìn)一步研究過程中可選擇不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，以期提高復(fù)查診斷發(fā)生HT的準(zhǔn)確率；其次，由于缺血性腦卒中患者發(fā)生尿路感染和吸入性肺炎的可能性較大，而本研究?jī)H檢測(cè)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞腺苷A2b受體mRNA的表達(dá)水平，尚未排除因感染因素造成溶栓治療后發(fā)生HT的影響，因此進(jìn)一步的研究可考慮將超敏C反應(yīng)蛋白納入檢測(cè)指標(biāo)以排除感染因素的影響[11]。另外，本研究沒有對(duì)患者經(jīng)治療后外周血腺苷A2b受體mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，雖然目前尚無因感染因素導(dǎo)致患者腺苷A2b受體表達(dá)水平發(fā)生變化，但是患者的病情嚴(yán)重程度可能會(huì)影響腺苷A2b受體的表達(dá)水平；最后，由于本研究樣本均來源單中心，樣本量小，未來更深入的研究需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，選取多中心樣本進(jìn)行前瞻性的研究。

綜合以上分析，本研究結(jié)果提示腺苷A2b受體表達(dá)水平是急性腦缺血患者溶栓治療后發(fā)生HT的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，檢測(cè)其水平對(duì)預(yù)測(cè)腦缺血患者溶栓治療后發(fā)生HT具有預(yù)測(cè)價(jià)值。