溶栓前A2b受體水平與腦缺血出血轉化的關系研究

雷明

缺血性腦卒中(ischemic stroke)是一種致死率和致殘率均較高的腦血管疾病，產生的原因主要是因腦血管發生閉塞導致腦組織缺血性損傷，發生急性腦卒中時應盡早開通阻塞血管、挽救缺血半暗帶，恢復腦組織血流供應，減輕因缺血造成的神經功能損害[1]。目前國內外公認的發病4.5 h內使用重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator, rtPA)進行靜脈溶栓治療能有效降低致殘率，但是出血轉化是靜脈rtPA溶栓治療后最常見且最嚴重的并發癥，部分患者會出現嚴重致殘甚至死亡，嚴重影響溶栓治療的安全性和臨床療效，導致臨床溶栓治療率不足5%，嚴重制約了靜脈溶栓治療的臨床應用[2-3]。因此，尋找有效預測腦缺血溶栓治療后出血轉化的指標對提高靜脈溶栓治療的安全性和有效性具有重要的臨床價值。有研究顯示腺苷受體在腦缺血中具有重要生物效應[4]，本研究旨在探討腺苷A2b受體對腦缺血溶栓治療后出血轉化的預測價值，為臨床提高靜脈溶栓治療的安全性和有效性提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

所有入選對象為2015年1月-2017年3月就診于本院的缺血性腦卒中患者83例，其中男53例，女30例，年齡63～75歲，平均年齡(65.2±6.3)歲，所有入選患者在其家屬簽訂書面知情同意的基礎上經醫院倫理委員會批準后開展本研究。入院開始治療前按照美國國立衛生研究院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale, NIHSS)進行神經功能評價。入選標準：所有病例符合中國急性缺血性腦血管疾病診斷標準2010版，發病在3 h以內，經頭顱CT和MRI確認存在血管閉塞或狹窄同時排除顱內出血，存在腦功能受損的體征超過1 h，且均經溶栓治療。排除標準：年齡<18歲者，既往有顱內出血史、腦梗死史、心肌梗死史，近半年內有頭顱外傷史，患有肝腎等重要內臟惡性腫瘤者，妊娠期女性，入院24 h內死亡者，不能耐受靜脈rtPA溶栓治療者。

1.2 腺苷A2b受體mRNA水平的檢測

采用RT-PCR法進行腺苷A2b受體mRNA表達水平的檢測，抽取患者靜脈血6 mL，經肝素抗凝后用Ficoll-Hypague淋巴細胞分離液獲取單個核細胞，然后加RPMI-1640培養液于室溫下培養15 h(5%CO2)，利用Trizol試劑提取總RNA后取1 μg，添加dT15(0.5 μg)、dNTPs(1mmol/L)、rRNasin(20U)、M-MLV逆轉錄酶(200U)至總體積25 μl，40 ℃進行1 h，然后92 ℃進行10 min。按上游5’-TTCTACGGCTGCCTCTTCCTCG-3’，下游5’-GCACTGTCTTTACTGTTCCACC-3’;上游5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’，下游5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’分別合成腺苷A2b受體和內參照GAPDH的引物，分別作227 bp、598 bp片段擴增。PCR循環條件為92 ℃變性2 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32次循環后取10 μL產物進行電泳(1.8%瓊脂糖凝膠)，利用顯微成像系統進行密度掃描計算相對比值。

1.3 溶栓治療

根據《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[5]的要求，所有患者在起病4.5 h內靜脈給予rtPA(商品名為愛通立，德國勃林格英格翰公司生產)進行溶栓治療，規格為20 mg/支，干粉制劑，按體質量的0.9 mg/kg給藥，最大劑量為90 mg，最初1 min內靜脈推注10%的劑量，剩余劑量持續靜脈微泵注入1 h。

1.4 出血轉化的評價及分組

患者經溶栓治療后24 h內進行頭顱CT和MRI復查，與治療前相比新發現有高密度(CT)、低信號(MRI)病灶，則認為是發生出血轉化，并分為HT組和非HT組。

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件，計數資料組間比較使用χ2檢驗，計量資料組間比較使用t檢驗，以P<0.05示差異具有統計學意義。采用多因素非條件Logistic回歸分析急性腦缺血患者經靜脈溶栓治療后發生HT的獨立危險因素。

2 結 果

2.1 出血轉化組與非出血轉化組患者一般臨床資料比較

經靜脈溶栓治療后發生HT者有36例，占43.4%。比較HT組和非HT組患者入院時的臨床資料顯示，2組患者在年齡、性別比例、吸煙史、TC、HDL-C、NIHSS評分均無統計學差異(P>0.05)，但2組患者在高血壓病、糖尿病方面存在明顯差異，HT組高于非HT組(P<0.05)(表1)。

表1 HT組與非HT組患者一般臨床資料比較

2.2 ROC曲線分析腺苷A2b受體在腦缺血溶栓治療后發生HT的預測價值

以是否發生HT為狀態變量，作腺苷A2b受體mRNA表達的ROC曲線，分析預測腦缺血患者經靜脈溶栓治療后發生HT的預測值為0.63，此時AUC=0.716，95%CI=0.628～0.837，P<0.001，敏感度71.3%，特異度為80.4%(圖1)。

圖1 腺苷A2b受體對溶栓后發生HT的診斷價值

2.3 logistic回歸分析經溶栓治療后發生HT的危險因素

將有統計學意義的變量進行多因素非條件logistic回歸分析顯示，腺苷A2b受體和高血壓病是經溶栓治療后發生HT的危險因素，而糖尿病不是經溶栓治療后發生HT的危險因素。

表2 logistic回歸分析經溶栓治療后發生HT的危險因素

2.4 經溶栓治療后HT組與非HT組NIHSS評分比較

在經溶栓治療后HT組與非HT組中每組再分為腺苷A2b受體>0.63組和腺苷A2b受體<0.63組，HT組NIHSS評分高于非HT組，同時HT組中腺苷A2b受體>0.63組的NIHSS評分最高，非HT組中腺苷A2b受體<0.63組的NIHSS評分最低。

表3 經溶栓治療后HT組與非HT組NIHSS評分比較，分)

3 討 論

腺苷是一種重要的神經遞質，當腦組織受損時其局部濃度增大與相應的受體結合，腺苷受體為G蛋白偶聯受體家族[6]。有研究顯示腺苷受體在腦缺血過程中具有神經保護作用，而腺苷A2b受體是與腺苷親和力最低的1個受體[7-8]。動物實驗研究顯示發生腦缺血時腺苷A2b受體被激活，其蛋白表達水平上調，cAMP釋放增加，從而加速糖原分解，增大神經元的能量供應，起到神經保護的作用[9]。當患者發生腦卒中局部腦組織缺血缺氧時主要分布在海馬的腺苷A2b受體則被激活，可能參與抑制興奮性神經遞質釋放，從而產生神經保護作用有關[10]。

本研究結果顯示，HT組患者外周血單個核細胞腺苷A2b受體mRNA的表達水平明顯高于非HT組，利用ROC曲線分析腺苷A2b受體mRNA表達對預測腦缺血患者經靜脈溶栓治療后發生HT具有一定的預測價值(AUC=0.716，95%CI=0.628～0.837，P<0.001，敏感度為71.3%，特異度為80.4%)，診斷臨界值為0.63，說明當患者外周血單個核細胞腺苷A2b受體mRNA的表達水平高于0.63時，應注意密切關注患者頭顱CT和MRI檢查，必要時進行動態觀察甚至再手術，及時調整治療藥物，降低患者發生HT的風險，以期提高患者治療的療效。經多因素非條件Logistic回歸分析顯示，腺苷A2b受體表達水平是腦缺血患者經溶栓治療后發生HT的獨立危險因素(OR=0.916，95%CI=0.899～0.969，P=0.032)，高血壓病也是經溶栓治療后發生HT的危險因素，但糖尿病不是經溶栓治療后發生HT的危險因素。經過溶栓治療后評價各組的NIHSS評分顯示，HT組中腺苷A2b受體>0.63組的NIHSS評分最高，非HT組中腺苷A2b受體<0.63組的NIHSS評分最低。

本研究過程中存在一定的局限性，首先患者經溶栓治療后24 h內進行頭顱CT和MRI復查判斷有無HT的發生，而CT和MRI的檢查仍然有可能會存在一定的漏診情況，不能確保100%準確率，在后期的進一步研究過程中可選擇不同的時間點進行動態觀察，以期提高復查診斷發生HT的準確率；其次，由于缺血性腦卒中患者發生尿路感染和吸入性肺炎的可能性較大，而本研究僅檢測患者外周血單個核細胞腺苷A2b受體mRNA的表達水平，尚未排除因感染因素造成溶栓治療后發生HT的影響，因此進一步的研究可考慮將超敏C反應蛋白納入檢測指標以排除感染因素的影響[11]。另外，本研究沒有對患者經治療后外周血腺苷A2b受體mRNA的表達水平進行重復檢測，雖然目前尚無因感染因素導致患者腺苷A2b受體表達水平發生變化，但是患者的病情嚴重程度可能會影響腺苷A2b受體的表達水平；最后，由于本研究樣本均來源單中心，樣本量小，未來更深入的研究需要進一步擴大樣本量，選取多中心樣本進行前瞻性的研究。

綜合以上分析，本研究結果提示腺苷A2b受體表達水平是急性腦缺血患者溶栓治療后發生HT的獨立危險因素，檢測其水平對預測腦缺血患者溶栓治療后發生HT具有預測價值。