蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的腫瘤壞死因子-α基因啟動子相關遺傳易感性分析

嚴興麗 楊學麗

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是各種原因引起的血管破裂，聚集在蛛網膜下腔，根據病因分為自發性和創傷性出血。腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)是SAH最嚴重的并發癥，也是影響結局轉歸因素之一[1-2]。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)是參與炎癥反應和特異性免疫應答的重要因子，既往研究結果顯示SAH在腦循環中會產生大量TNF-α[3-4]。本研究選擇2014年2月-2017年2月就診于本院的168例SAH患者，比較TNF-α啟動子區5個位點SNPs，-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C在蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣患者中的頻率分布,以探討TNF-α基因相關遺傳易感性和SAH后CVS的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2014年2月-2017年2月就診于本院的蛛網膜下腔出血患者168例，均經過CT或腦脊液檢查確診，并記錄患者的一般臨床資料及Hunt-Hess分級。經顱多普勒和腦血管造影聯合診斷腦血管痙攣，因為手術或者介入治療前為腦血管痙攣發生的高峰期，用經顱多普勒測大腦中動脈和大腦前動脈的血流速度(Vm)，以最高流速Vm≥120 cm/s診斷為腦血管痙攣，<120 cm/s提示無腦血管痙攣[4-5]。腦血管痙攣組與非腦血管痙攣組各84例，其中腦血管痙攣組男39例，女45例，年齡47.6～67.4歲，平均年齡(55.3±6.5)歲；非腦血管痙攣組男38例，女46例，年齡46.3～66.9歲，平均年齡(54.7±6.1)歲。同期選取84例正常成年人作為對照組，男40例，女44例，年齡48.1～68.2歲，平均年齡(55.7±6.3)歲，3組性別、年齡等一般資料比較無明顯差異(P>0.05),具有可比性。

1.2 TNF-α基因啟動子區基因型及等位基因頻率分布檢測

首先，從外周血提取基因組DNA，應用聚合酶鏈反應和序列特異性引物-PCR(SSP-PCR)方法對TNF-α基因啟動子區5個位點(-238G A、-308G A、-857C T、-863C A)[6]進行分析，各位點的基本情況見表1。具體操作步驟為(1)對基因片段進PCR擴增，25 μL的擴增體系(聚合酶、模板基因組DNA、緩沖液、MgCl2、引物、dNTPs)；(2)預變性及變性(溫度均為94 ℃)；(3)退火：退火溫度30 s；(4)延伸：72 ℃延伸30 s，30個循環，然后72 ℃延伸10 min；(5)鑒定PCR產物：用2%瓊脂糖凝膠電泳15 min，120 V紫外燈下鑒定；其次用特異性限制內切酶消化PCR產后消化產物用3%瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切產物鑒定基因型。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 CVS相關臨床資料比較

本研究中由5 個位點-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C基因型和等位基因頻率為遺傳平衡群體。CVS(+)組與CVS(-)組年齡、性別、高血壓病史及CT Fisher分級均無明顯差異(P均>0.05)，Hunt-Hess分級構成比有明顯差異(P<0.05)(表2)。

表1 TNF-α啟動子區SNP分型方法

表2 CVS相關臨床資料

2.2 TNF-α基因啟動子區基因型及等位基因頻率分布

3組-238G/A及-863C/A位點的基因型和等位基因有明顯差異(P<0.05)(表3)。

2.3 蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣發生的多因素分析

對相關臨床資料及多態性等因素作多因素Logistic回歸分析發現-238G/A、-863C/A基因型和Hunt-Hess分級為與腦血管痙攣有關的危險因素 (P<0.05)(表4)。

表3 對照組、CVS(-)組與CVS(+)組-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C多態性比較

表4 多因素logistic回歸分析

3 討 論

腦血管痙攣是蛛網膜下腔出血后最常見、最嚴重的并發癥之一，也是影響患者致死率和致殘率的主要原因[7]。但是關于蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的發病機制和原因尚不清楚，多數學者認為這是由多因素決定的，常見的比如血管活性物質、炎癥反應因子(如TNF-α)[7-8]。本研究對TNF-α基因啟動子區的5個SNPs即-238G/A、-308G/A、-857C/T、-863C/A、-1031T/C與SAH后CVS的關系進行了分析，結果顯示-238G/A、-863C/A基因型是SAH后發生CVS的易感因素(P均<0.05)。進一步分析顯示-238G/A、-863C/A基因型和Hunt-Hess分級為與腦血管痙攣有關的危險因素(P<0.05)。含SNPs的等位基因特異反應元件與反式作用因子的結合情況決定了SNP對于細胞因子的影響情況，其中TNF-α基因-238位在DNA-結合蛋白與啟動子的結合區，與啟動子的活性密切相關，-863位在核因子(NF-κB)結合序列中，與后者的穩定性密切相關，如果C被A取代，會影響轉錄[9-10]。

TNF-α在體內往往通過與其受體結合，調節凋亡通路中的蛋白表達，影響平滑肌細胞及內皮細胞的凋亡速度。另外，TNF-α是炎性因子，會激活炎癥反應系統，趨使白細胞等向損傷位置移動，破環血管壁完整性，引起局部血管擴張[11]。目前已有研究顯示，TNF-α高表達更易發生蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣，這與本研究結果一致，可能與TNF-α參與血管炎癥反應等密切相關[12]。

尋找蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的易感基因，并篩查易感人群，對于早期預防、及時診斷和治療有著十分重要的意義。本研究結果顯示-238G/A、-863C/A位點及其基因型是蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的易感基因，但是關于TNF-α基因對于腦血管痙攣的發病機制，尚需擴大樣本量，采取多中心研究進一步探討。