液基細胞制片聯合巴氏染色觀察實體瘤腦膜轉移患者腦脊液中腫瘤細胞形態學特點

龐曉川 李 琳 王永香 潘振宇

(吉林大學第一醫院檢驗科，吉林 長春 130021)

腦膜轉移也稱腦膜癌病或癌性腦膜炎，指腫瘤細胞侵入蛛網膜下腔腦脊液中，彌漫浸潤軟腦膜或蛛網膜(柔腦膜)〔1〕。實體瘤腦膜轉移既往被認為是一種罕見的致死性并發癥。隨著惡性腫瘤治療效果改善，患者生存期延長，包括腦膜轉移在內的遠地轉移發生率隨之增加。全身化療藥物廣泛應用，使中樞神經系統成為腫瘤細胞最終的避風港。近年來，腦膜轉移的發生率明顯上升。由于本病造成中樞神經系統彌漫受累，癥狀復雜多樣，影像學檢查缺少特異性，診斷困難。腦脊液細胞學檢查找到惡性細胞是腦膜轉移診斷的特異性標準〔1〕。由于既往診斷的病例數有限，且傳統細胞學檢查技術對細胞形態結構顯示欠佳，細胞學檢查往往被用于良惡性的判定〔2〕，而腦膜轉移患者原發腫瘤的病理類型仍主要依靠組織學檢查。目前認為，約有10%的腦膜轉移患者既往無腫瘤病史〔1〕。近年來，常見以腦膜轉移起病，原發灶隱匿或難以判定的患者〔3～5〕。

采用免疫化學法定性細胞來源的方法往往需要聯合多種免疫標記物。然而，不同于胸腹水標本，腦脊液取材標本量有限，難以保存；絕大部分標本缺少足夠細胞數量以離心出細胞球，進行固定包埋。這使得免疫細胞化學法檢測腦脊液中腫瘤來源及類型的應用受限，并不被廣泛應用〔6,7〕。另外，早有研究發現，腦脊液免疫細胞化學法較常規細胞學方法未能增加檢查的敏感性，不作為腦膜轉移診斷的推薦檢測項目〔7～9〕。目前，基于細胞形態學的細胞學檢查仍是實體瘤腦膜轉移的主要細胞學檢查方法。

液基細胞學技術是細胞病理學技術的重大進展，其采用流體力學原理及高精密過濾膜進行細胞采集，電化學技術使細胞向玻片上自然吸附，不僅可充分收集標本中的細胞成分，且對細胞無明顯擠壓等外力作用。整個制片及固定過程均保持了原有液態環境，降低細胞暴露于空氣發生退變、損傷的概率。既往研究認為〔10～12〕，此方法適用于惡性實體腫瘤腦膜轉移患者腦脊液細胞學檢查，且利于腫瘤細胞形態學觀察與分析。本文通過觀察采用此技術進行腦脊液細胞學檢查陽性的標本，總結不同病理類型腫瘤細胞形態特征表現，希望對提高腦脊液腫瘤細胞診斷水平有所幫助。

1 材料與方法

1.1研究對象 回顧吉林大學第一醫院2009年9月至2014年5月收治的采用液基細胞制片聯合巴氏染色的腦脊液細胞學檢查方法獲得細胞學診斷的惡性腫瘤腦膜轉移患者。排除神經源性及血液系統來源惡性腫瘤，排除原發灶來源診斷不明患者，共81例患者入組。女42例，男39例，年齡37～ 72歲(中位年齡54歲)。其中，68例患者既往有惡性腫瘤史，包括肺腺癌29例、肺鱗癌1例、肺小細胞癌14例、肺大細胞癌1例、乳腺癌17例、胃腺癌3例、乳腺及肺雙重癌1例，肝細胞癌1例，喉鱗癌1例；其余13例以腦膜轉移為首發，進一步檢查診斷肺腺癌9例，胃黏液腺癌2例，肺小細胞癌1例，原發顱內惡性黑色素瘤1例。除原發中樞惡性黑色素瘤外，其余患者均有組織學病理檢查證實。按照細胞病理類型分為6類，腺癌60例、鱗癌2例、小細胞癌16例、大細胞癌1例、肝細胞癌1例、惡性黑色素瘤1例。

1.2腦脊液細胞學檢查 全部腦脊液標本來源于患者治療前的腰穿術，檢查次數為1～4次，單次采集標本量6～12 ml。采集后需立即送檢，盡早進行標本制片處理。

采用液基制片聯合巴氏染色的細胞學檢查方法：標本采集后加入10 ml PreservCyt細胞保存液混合，靜置15 min以上；使用新柏氏2000液基細胞自動制片機制片；95%乙醇固定15 min；常規巴氏染色。

1.3閱片，總結及分析細胞形態學特征 所有標本由3名細胞病理專業醫生鏡下閱片。根據患者組織學檢查確定的腫瘤病理類型進行分類，總結分析不同類型的細胞形態學特征表現，主要包括細胞一般形態及分布、胞質、核、染色質、核仁及細胞內特殊結構的表現特點。

2 結 果

顯微鏡下觀察細胞形態結構(圖1)，90%以上標本制片染色效果滿意，雜質少，細胞退變少，可以清楚觀察細胞形態?？偨Y分析不同類型惡性細胞的形態特點(表1)，腺癌細胞：細胞體積明顯增大，多呈圓形或橢圓形，散在或團簇分布；胞質深染，部分含有空泡；單核或多核，核質比多明顯增大，也可較小，居中或偏位；染色質多為不均勻團片狀深染，部分有細顆粒感；多有紅染或藍黑深染核仁，大小不一，數目不定；偶可見病理性核分裂象、胞質橋、細胞吞噬等表現。鱗癌細胞：體積較大，圓形或不規則形，散在或團簇分布；部分角化胞質為粉紅色，伴細胞核縮?。欢鄦魏?，核質比明顯增大；染色質呈棉絮或顆粒樣深染；大部分細胞核內具有多個紅染核仁，多位于細胞核周邊。小細胞癌：多團簇分布，細胞體積相對其他腫瘤細胞較小；單核，核質比極大，似裸核；染色質粗顆粒樣深染；未見明確核仁。大細胞癌：散在或小簇分布，體積大，邊界欠清；多單核；染色質粗顆粒樣深染；未見明顯核仁。肝細胞癌：散在分布，體積大，形態規整，邊界清楚；胞質均勻深染，部分胞質中可見點狀顆粒結構；染色質均勻深染，缺少顆粒感；大部分細胞核內可見單一圓形鮮紅色核仁，體積大，多位于細胞核中央。惡性黑色素瘤：體積大，圓形，散在或小簇分布；胞膜有環周的偽足樣突起；單核；核中央可見單一紅色核仁，邊界不清，體積較大；核或胞質中可見大小不等黑色塊狀物質。

表1 腦脊液中不同類型腫瘤細胞顯微鏡下特點

續表1 腦脊液中不同類型腫瘤細胞顯微鏡下特點

A～H：腺癌；I、J：鱗癌；K：小細胞癌；L、M：大細胞癌；N、O：肝細胞癌；P：惡性黑色瘤圖1 腦脊液細胞學檢查(液基制片，巴氏染色，× 400)

3 討 論

正常腦脊液細胞成分相對簡單，腫瘤細胞的形態特點明顯區別于淋巴細胞、單核細胞等固有的細胞成分。因此，腦脊液細胞學檢查對于非血液系統惡性腫瘤細胞的定性具有高度特異性〔2,6〕。惡性細胞的判定主要依靠細胞形態區別于腦脊液中正常細胞，并具有顯著惡性特征。目前被廣泛認可的細胞惡性形態學特征包括〔13〕：明顯超過正常腦脊液細胞體積的異常大細胞；異常細胞間大小不一，多形性；細胞深染；核質比增大；多核、核不規則或有角狀突起；核染色質深染、染色不均；多核仁；病理性核分裂象、胞質橋等。既往的細胞學檢查方法，可以觀察到以上惡性特征，并進行定性診斷，但多難以清楚觀察到更加細致的形態結構，無法進行細胞分類〔6,14〕。

進一步研究發現〔13,15,16〕，腦脊液標本采集量少(<10.5 ml)，采集后未能及時制片處理(>90 min)，以及標本制片固定的過程中細胞暴露于空氣中時間較長，是造成細胞退變、形態破壞、難以觀察的主要因素。采用液基細胞制片技術的細胞學檢查方法，可在技術上改善腦脊液中腫瘤細胞的保護，減少空氣暴露，減少細胞退變，提高檢出率〔12〕。本研究認為，液基細胞學技術在腦脊液腫瘤細胞的形態學觀察方面具有明顯優勢。腫瘤細胞形態結構的清晰顯示，不僅幫助細胞性質的判定，并能針對不同病理類型腫瘤細胞進行特征性表現的分析總結，使我們能夠對腦脊液腫瘤細胞的病理類型進行判斷。

巴氏染色法早已被發現在宮頸癌、泌尿系統腫瘤等上皮來源惡性腫瘤的細胞學檢查染色中具有明顯優勢〔17〕。實體腫瘤中以上皮來源惡性腫瘤為主，其腦脊液標本的腫瘤細胞染色適合采用巴氏染色法。本組標本中，巴氏染色多將腫瘤細胞胞質染為藍色或藍綠色，核染色質染為藍紫色或藍黑色，核仁多為紅色。胞質、核染色質及核仁等不同細胞結構間顏色對比鮮明，便于觀察。液基細胞制片聯合巴氏染色充分集合了細胞保護與形態結構顏色鮮明的特點，良好顯示了細胞原有特征。染色質及核仁的顯示細膩、清晰，是此方法的重要優勢。

不同病理類型的腫瘤細胞具有不同的形態特征，這些特征主要表現在細胞核、染色質、核仁等細胞結構上的差異。腦膜轉移最多見的細胞類型為腺癌，其結構形態最為多樣，缺乏特征性，可能是由于原發腫瘤來源于多種不同器官所致。腺癌細胞核染色質多為不均勻團片狀深染，部分具有顆粒感，這種顆粒感相對小細胞癌及大細胞癌較為細膩；也可見泡沫樣或棉絮樣胞質；多有核仁，大小不一，數目不定，核仁體積多小于肝細胞癌、大于鱗癌；部分胞質內可見空泡，具有一定特征性；偶可見多種異常核分裂象、胞質橋、細胞吞噬及細胞單層上皮樣排布，這些表現未出現于其他腫瘤細胞標本。鱗癌細胞核內?？梢姸鄠€細小紅染核仁，并多位于核周邊；部分角化胞質均勻粉染，細胞核縮小，核漿比減小，核仁顯示不清為其主要特征。小細胞癌及大細胞癌細胞染色質呈粗顆粒樣深染，多單核，核漿比極大，似裸核，為其主要特征；二者間比較，小細胞癌體積明顯小于大細胞癌，且小細胞癌多為團簇分布，未見多核及核仁；部分大細胞癌細胞核內可見圓形細小核仁。肝細胞癌具有較多特征性，染色質均勻深染，缺少顆粒感；核內多有單個大體積單個核仁，多位于細胞核中央。惡性黑色素瘤細胞具有明顯特征性，易于鑒別：細胞周邊明顯的環周偽足突起；核中央可見單個且邊界不清紅色核仁，體積較大；核或胞質中可見大小不等黑色顆粒物質。

腦脊液中罕見鱗癌、大細胞癌、肝細胞癌等，既往缺少此類細胞在腦脊液中的形態學觀察報道。本研究中鱗癌、大細胞癌、肝細胞癌等患者數量少，故根據現有的資料總結分析出的相應特征表現可能并不全面。希望隨著腦脊液細胞學檢查技術設備的進步，觀察及研究的深入，將會有更加全面而系統的腦脊液細胞形態學分析及分類標準，促進實體腫瘤腦膜轉移的腦脊液細胞學診斷取得新的發展。