三葉因子3的調控及作用機制

林 旭 吳靖芳 高福祿

(河北北方學院形態學實驗室，河北 張家口 075000)

腸三葉因子(TFF)3是三葉因子家族(TFFs)中最后被發現的一個成員，生理情況由胃腸道杯狀細胞特異性表達。研究表明，當胃腸黏膜發生炎癥、潰瘍等病變時，TFF3的表達上調，誘導細胞遷移，參與黏膜保護及受損黏膜的修復過程；并且在多種惡性腫瘤高表達〔1〕。本文就TFF3的調控及作用機制進行綜述。

1 TFF3的分子結構

TFF3是由59個氨基酸組成的6 700個小分子分泌性多肽，位于21 號染色體長臂(21q22.3)，基因跨越2 295 bp，含有3個外顯子、2個內含子。其cDNA為222 bp，編碼73個氨基酸，前22個氨基酸為信號肽，后 59個氨基酸為成熟肽。第 1個外顯子含 ATG 起始密碼，編碼14個氨基酸的信號肽及 6 個氨基酸的N末端；第2個外顯子編碼三葉狀結構基因；第3個外顯子編碼 C末端和一個長的含2個多聚腺苷酸化序列的 3′非翻譯區〔1〕。TFF3肽鏈中42個氨基酸(Gln10 到 Pro51)通過6個高度保守的半胱氨酸殘基按照1-5，2-4，3-6的順序形成3個分子內二硫鍵，折疊形成“三葉狀”結構，也叫P結構域〔2〕。TFF3的C端氨基酸序列非常保守，已鑒定的不同種屬TFF3(63%)是相同的，C端對TFF3的生物學功能要比N端重要。TFF3經常形成同源或異源二聚體，第7位半胱氨酸對于二聚體形成至關重要〔3〕。天然狀態的TFF3既有單體又有二聚體的存在形式。TFF肽特有的緊密結構使其在胃腸道上段具有強烈的耐酸和胰、糜蛋白酶能力。TFF3主要由黏膜上皮分泌并與黏蛋白共分泌形成黏液凝膠，保護黏膜。三葉草結構域環2與環3之間的裂隙主要是寡糖類(如黏蛋白)或芳香族氨基酸結合位點〔4，5〕，TFF3的P結構域賦予其穩定、緊密的結構，在強消化酶、強酸的消化道環境中能保持結構和功能的完整，發揮黏膜保護和損傷修復作用。hTFF3 基因啟動子上游 2 000 bp正負鏈轉錄因子結合部位共計 204 個，主要包括基本轉錄因子Sp1、CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)α、核轉錄因子(NF)-κB、雌酮(E1)、轉錄因子(AP)-1、雌激素受體(ER)、八聚體結合轉錄因子(Oct)-1、GATA結合蛋白(GATA)-3、糖皮質激素受體(GR)、原癌基因c-Jun、c-Fos、N-Myc、AP-2等，其中Sp1對維持TFF3轉錄活性有重要作用〔6〕，見圖1～3。

圖1 TFF3 P結構域

圖2 TFF3二聚體

C半胱氨酸殘基，C為形成TFF3二聚體的半胱氨酸殘基圖3 TFF3的氨基酸序列

2 TFF3的表達與功能

2.1TFF3的正常表達 最早發現TFF3由小腸杯狀細胞分泌；人類唾液腺，嚙齒動物的胰腺和人前列腺，女性生殖器官，泌尿生殖系統、結膜和淚器均可表達TFF3〔7〕。Wiede等〔8〕研究顯示人呼吸道和子宮有大量TFF3 mRNA累積，而TFF1、2幾乎沒有〔8〕。Belovari等〔9〕研究發現小鼠和大鼠星形膠質細胞表達TFF1和TFF3。腦組織TFF3 mRNA轉錄局限在海馬、顳葉皮質和小腦3個腦區。TFF3蛋白在發育中大鼠、人不同腦區及脊髓均有表達。小鼠胚胎TFF3表達于神經節細胞、脊髓及延髓神經元〔9〕。大鼠腸三葉肽TFF3主要由垂體前葉細胞、丘腦室旁核神經元合成并與促乳素共存于大細胞部神經元〔10〕。同時，Paterson等〔11〕也證實腦脊液含TFF3，低水平TFF3與廣泛的腦室擴張、全腦及海馬萎縮有關，并可作為神經退行性變的標志物。Bernstein等〔12〕以免疫組化技術系統研究了成人腦組織TFF3表達模式，發現TFF3主要分布于丘腦外側腦區；人胚胎神經元尤其中腦和腦干神經核團是表達TFF3的主要細胞，少突膠質細胞和脈絡叢上皮也呈TFF3陽性。大腦TFF3主要功能是參與恐懼、抑郁、學習、阿片成癮等活動。

2.2TFF3肽的病理表達 研究表明TFF3肽在多數腫瘤發展過程中過表達，在人類實體腫瘤的致癌性轉化、生長和轉移過程發揮積極作用〔13〕。文獻報道TFF3在腫瘤中具有兩面性，既可作為腫瘤進展標志物，也可作為腫瘤抑制因子〔7〕。May等〔14〕報道TFF1和TFF3基因在乳腺增生和腫瘤組織及乳腺癌MCF-7細胞均高表達。但在視網膜母細胞瘤和未分化甲狀腺癌中TFF3低表達〔15，16〕。上調一般是由炎癥和潰瘍性引起。TFF3高表達和TFF1低表達是胃上皮化生的標志，生理情況下TFF3在腸道黏膜高表達，胃癌TFF3高表達是預后不良的標志。人類結腸癌、胰腺癌、乳腺癌和肝細胞癌TFF3高表達促進了癌癥進程。肝細胞癌TFF3高表達與肝癌的腫瘤分級有關。前列腺癌患者TFF3陽性，血清水平TFF3升高，被認為是晚期前列腺癌的標志物；近年研究表明TFF3還可作為乳腺癌、結直腸癌診斷標志與遠期療效及復發率預測標志物或胃腸癌化療藥物的藥代動力學監測指標〔14，17～19〕。

3 TFF3表達調控機制

3.1蛋白質和化學物質對TFF3的調節 ①TFFs相互誘導與自分泌：腸道杯狀細胞的TFF3基因啟動子含有順式調控增強子和沉默子區域(GCSI)，核蛋白與之結合，調節杯狀細胞TFF3特異性轉錄〔20〕。Taupin等〔21〕研究表明，TFF2和TFF3可以與啟動子順式作用元件結合通過分裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外信號調節激酶(ERK)途徑增強小腸和胃細胞系中3個TFF肽的表達；另外，TFF3敲除小鼠不僅有TFF3的表達缺失，同時也伴有TFF1和TFF2的低表達。②雌激素調節：2014年，Sun等〔6〕成功擴增了hTFF3啟動子區域，生物信息學分析證實這個區域包含1個Sp1轉錄因子結合位點，Sp1能增強hTFF3基因啟動子的轉錄，從而增加hTFF3表達。TFF3基因啟動子區有2個雌激素反應元件(ERE)，所以雌激素也能調節乳腺癌細胞TFF3表達〔22〕。此外，處于月經周期的子宮內膜上皮細胞TFF3高表達，與雌激素水平有關〔8〕。植入期子宮內膜TFF3低表達與此時子宮內膜的屏障功能降低，利于胚泡著床有關〔23〕。Mhawech-Fauceglia等〔24〕最近研究發現TFF3表達與ER在子宮內膜腺癌具有相關性，雌激素促進子宮內膜腺癌TFF3的上調，在Ⅰ型子宮內膜癌中與良好的預后有關。③炎癥因子：人支氣管上皮細胞系(BEAS-2B)分泌TFF2 和TFF3通過蛋白激酶(PK)C和ERK1/2途徑促進腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導的白細胞介素(IL)-6和IL-8表達〔25〕。在炎性腸病中TNF-α誘導NF-κB活化，降低TFF3表達，并作為促炎因子導致潰瘍形成。同樣，TNF-α刺激可以引發HT-29細胞系TFF3表達降低10倍以上，證實了TNF-α下調TFF3是通過NF-κB途徑實現的。實驗性結腸炎的急性期腸上皮NF-κB的活化降低TFF3表達〔26〕。Blanchard等〔27〕研究表明甲氨蝶呤刺激結腸癌HT-29細胞TFF3表達上調與IL-4和IL-13活化信號傳導及轉錄激活因子(STAT)6有關。④Toll樣受體(TLR)2：杯狀細胞TLR2活化可誘導TFF3表達，而TFF3缺失導致創傷愈合減慢，當給予rTFF3 治療時創傷愈合加速。TLR2活化選擇性誘導TFF3合成。TLR2-缺陷小鼠急性結腸炎的發病率和死亡率升高，口服rTFF3可降低死亡率〔28〕。

3.2TFFs的表觀遺傳學調節 表觀遺傳學是基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，即研究在沒有細胞核DNA序列改變時，基因功能可逆、可遺傳的改變。主要包括DNA甲基化和組蛋白乙酰化。DNA甲基化是在DNA甲基化轉移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共價鍵結合一個甲基基團。表觀遺傳機制也參與了癌癥TFF表達的調控。在腸道、胰腺癌、人胰腺導管癌、肝細胞癌中，TFF3高表達常與其啟動子低甲基化共存。前列腺癌細胞系和前列腺癌組織TFF1和TFF3啟動子區低甲基化與TFF1和TFF3高表達密切相關。DNA甲基轉移酶抑制劑5-Aza-dC增加低表達TFF3的前列腺癌細胞中TFF3表達〔29〕。組蛋白乙酰化對TFF3的影響未見報道。

3.3miRNAs對TFFs的影響 miRNAs是約22個核苷酸長度的小非編碼RNA分子，在細胞分化、細胞周期、生長和凋亡等過程中發揮重要作用。miRNAs失調在不同疾病和癌癥中發揮關鍵作用，也參與TFFs的表達調節。Sousa等〔30〕研究發現過表達miR-30可通過肝細胞核因子(HNF)4γ依賴途徑靶向下調腸化生標志物人絨毛蛋白(VIL)1、TFF2和TFF3。Rotkrua等〔31〕發現過表達和敲低miR-9表達可以改變胃癌MKN45和 NUGC-3細胞系尾型同源盒基因(Cdx)2蛋白及下游靶基因TFF3的表達。

3.4受體和信號通路 ①TFFs結合蛋白：TFF的生物學功能是通過細胞表面受體-配體途徑介導的。然而，迄今為止并沒有發現明確的TFF高親和性結合受體。②TFFs下游信號通路：Emami等〔32〕在對人結腸癌PC/AA/C1細胞和狗腎MDCK上皮細胞的研究中發現過表達TFF3可誘發凝膠劑內的細胞分散式生長，三葉肽可以通過激活Src原癌基因及RhoA蛋白來誘發細胞的分散，致使其遷入膠原蛋白凝膠劑內。與TFFs生物學功能有關的信號通路包括磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)，Rho-ROCK級聯，COX-2/TXA2-R/Gαq 信號途徑，PLC/PKC，MAPK和表皮生長因子受體(EGFR)信號通路〔32，33〕。另外，COX-2，ERK1/2，JNK，Akt，NF-κB和EGFR酪氨酸激酶等也參與TFF的信號調節〔32，34〕。結腸細胞系中TFF1和TFF3通過活化MAPK/ERK信號通路發揮抑制生長的效應，結直腸癌HCT8/S11細胞系的浸潤通過TFF1以COX-2和TXA2-R依賴途徑啟動。胃癌細胞SGC7901中TFF3通過Twist依賴方式調節細胞遷移，TFF3促進SGC7901細胞遷移時Twist途徑被激活，相反，以siRNA介導的Twist敲低表達可以消減TFF3誘導的SGC7901細胞遷移，同時，遷移相關標志物細胞角蛋白(CK)-8、緊密連接蛋白(ZO)-1和基質金屬蛋白酶(MMP)-9表達也通過Twist途徑由TFF3調控〔35〕。TFF3還可通過STAT3磷酸化調節腫瘤血管生成、細胞侵襲、遷移和惡性轉化。Pandey等〔36〕研究發現TFF3陽性與乳腺癌腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期和不良預后密切相關；體外實驗中強制MCF7和T47D的乳腺癌細胞系表達TFF3，可促進癌細胞浸潤、遷移和增強成瘤性，裸鼠體內移植后，轉移結節明顯增多；而siRNA沉默TFF3降低乳腺癌細胞侵襲、轉移能力。該作用是通過c-Scr磷酸化活化STAT3導致E-鈣黏蛋白(cadherin)表達下調所致。

3.5細胞保護和能動性機制 TFF3通過PI3K/Akt信號通路促進黏膜細胞完整性和抗凋亡。外源TFF3也可保護HCT116結腸癌細胞和正常大鼠小腸上皮細胞(IEC)-6上皮細胞免于細胞凋亡。這種影響可被渥曼青霉素(wortmannin)和酪氨酸磷酸化抑制劑A25翻轉，表明PI3K和EGFR的激活可能參與TFF3的抗凋亡過程〔37〕。TFF3陽性HT-29細胞系中PI3K激活的下游產物磷酸化AKT的表達升高。TFF3可以減輕脂多糖誘導的胃黏膜細胞(GES)-1細胞凋亡，細胞活力降低及受損的細胞緊密連接。抑制活化PI3K/Akt通路，TFF3對GES-1細胞保護作用下降，可見TFF3促進胃黏膜上皮細胞增殖、遷移及抗凋亡，維持胃黏膜上皮完整性，是通過PI3K/Akt信號通路的活化介導的〔32〕。TFF3可以通過活化PI3K和EGFR抑制化療藥依托泊甙通過p-53途徑導致胃癌細胞系死亡，然而在TFF3缺陷小鼠模型未檢測到Fas或TNF受體介導的凋亡途徑或凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Bad或Bcl-xL基因表達差異〔37〕。TFFs在上皮重建中也有關鍵作用，上皮重建的第一步是減少細胞間接觸，3個TFF肽均可誘導黏著小帶E-cadherin/β-catenin復合體下調，利于TFF的促遷移作用。Meyerzum Buschenfelde等〔38〕轉染穩定表達Flag標簽的人TFF3后，TFF3通過下調E-cadherin、增加緊密連接蛋白(Claudin)-1水平和降低Claudin-2途徑影響HT29、MDCK細胞的黏附連接功能，促進細胞遷移。一個完整的P結構域或二聚體均不能促進細胞移行，TFF3的促修復活性與其突變體激活MAPK相關，不受EGF受體磷酸化調控。相反，只有完整的ITF才能保持HCT116和IEC-6細胞中PI3K和EGF受體活性，發揮抗凋亡作用。這些結果提示TFF3對細胞遷移和凋亡的影響是通過不同的細胞內信號轉導途徑介導的〔39〕。

4 TFF3敲減和過表達的體內外效應

4.1體內效應 TFF3-/-小鼠角膜創傷修復時間明顯比TFF3+/+小鼠延長〔40〕。 TFF3-/-缺陷小鼠結腸細胞凋亡增加、黏膜愈合能力明顯減弱，并且更易罹患化療和放療所致的黏膜炎，增加口服硫酸葡聚糖引起的大腸炎死亡率〔41〕。相反，Marchbank等〔42〕研究發現TFF3缺陷的小鼠細胞凋亡相對增強，且與應激或受體相關的細胞死亡調節因子Fas或Bcl無關。空腸異常表達大鼠TFF3的轉基因小鼠，并未增加細胞增殖、遷移和凋亡的改變。

4.2體外效應

4.2.1TFF3過表達與敲減抑制和誘導凋亡 外源TFF3可以拮抗血清饑餓引起人結腸癌HCT116細胞和大鼠腸上皮細胞凋亡〔37〕。同樣，TFF3通過增加腸上皮細胞NF-κB激活 (p50/p65)異源二聚體的活性，增強IEC-18細胞的抗凋亡能力，NF-κB阻斷劑則顯著降低IEC-18細胞的抗凋亡能力。相反，反義TFF3能增加人胃癌細胞的化學敏感性和凋亡。以TFF3抗體中和分泌性TFF3促進乳腺癌細胞凋亡〔43〕。然而Rosler等〔44〕在軟骨性骨關節炎研究中提出TFF3促凋亡，發現TFF3通過活化MMP增加軟骨細胞凋亡誘導。

4.2.2TFF3過表達與敲減在細胞增殖中的作用 Sun等〔33〕報道TFF3通過活化PI3K/Akt通路促進胃黏膜上皮細胞增殖，與rTFF3通過活化 ERK1/2信號通路促進胃內皮GES-1細胞系增殖相似。此外，乳腺癌和前列腺癌細胞過表達TFF3明顯促進細胞增殖和提高活力〔43，45〕。相反，Uchino等〔46〕研究表明TFF3抑制結直腸癌細胞系增殖，結腸癌細胞系LoVo和SW837中穩定轉染TFF3，過表達TFF3的細胞在體外或接種到動物體內生長速度明顯減慢，而且這一效應的發生與EGFR誘導的MAPK/ERK的磷酸化及其活性抑制相互伴隨。在外源rTFF3作用24 h后人角膜上皮細胞生長減慢〔47〕。

4.2.3TFF3過表達與敲減在遷移、侵襲中的作用 TFF3促進甲狀腺乳頭狀癌K1細胞、口腔上皮、人支氣管上皮細胞增殖、遷移〔48〕。rTFF3增加小腸上皮IEC-6細胞系劃痕愈合速度〔49〕。TFF3也能促使胃GES-1細胞系和人結腸癌細胞系遷移和侵襲。與此同時，無侵襲性大鼠結腸癌細胞轉染TFF3后增加了細胞的遷移、侵襲和惡性行為。siRNA介導敲低轉移大鼠結腸癌細胞系TFF3表達則明顯抑制遷移和侵襲〔18〕。前列腺癌和乳腺癌過表達TFF3增加細胞軟瓊脂成瘤能力，促進細胞遷移和浸潤〔43，45〕。過表達TFF3的乳腺癌細胞促進裸鼠移植瘤的生長，抗體中和TFF3后，可阻滯移植瘤生長〔43〕。

綜上，TFF肽的表達變化似乎是許多類型腫瘤的共同特征。TFF3影響致癌過程的關鍵功能如：細胞存活、凋亡、細胞遷移和侵襲調節。然而TFF3作為一個廣泛的一般標記癌癥潛在標志物，尋找新的診斷策略，具有挑戰性，能為未來的靶向癌癥提供有用的新治療工具。