SIRT1基因多態性與海南省長壽人群的相關性

陳小萍 甯超學 姚 堯 朱 喬 曾 倩 邢文婷 王夢蕓 趙亞力 欒復新

(中國人民解放軍總醫院海南分院中心實驗室，海南 三亞 572014)

闡釋壽命調控機制，實現延緩衰老、延長壽命一直以來是人們關注的焦點和自然科學研究的熱點。衰老的分子機制也揭示物種的壽命在一定程度上受遺傳因素控制，在線蟲中借助基因的突變即可抑制生命進程中的衰退性改變，從而延長壽命〔1〕。人類基因組單體型圖(HapMap)構建了不同人群的高密度SNP圖譜，為我們解釋復雜疾病的遺傳因素，建立特定疾病風險與SNPs之間的聯系創造了條件〔2〕。沉默信息調節因子(sir)2相關酶類(SIRT)是一種依賴NAD+的去乙酞化酶類，包括SIRT1～7共7個成員，其中以SIRT1的研究最詳盡。SIRT1通過組蛋白/非組蛋白去乙酰化基作用影響基因的轉錄，在抵抗應激，調節細胞凋亡和能量代謝方面發揮重要作用〔3〕。百歲老人作為人類健康長壽的主要象征，其腫瘤、糖尿病、免疫系統疾病的發病率低于普通人群〔4，5〕，針對百歲老人和普通人群的對比調查將有助于發現影響人類衰老和壽命的關鍵因素。截至2013年海南省存活百歲老人1 944人，每十萬人中有百歲老人21.46人，因此在2014年海南島被國際老齡化長壽專家委員會授予“世界長壽島”稱號〔6〕。有研究證實SIRT1與多個地區人群長壽和復雜性疾病相關〔7〕，但目前對于海南長壽人群SIRT1基因研究尚未見有報道，因此我們對SIRT1基因多態性與海南省長壽人群的相關性進行分析。

1 對象與方法

1.1研究對象 由中國人民解放軍總醫院海南分院多科室組成的調研團隊在2014～2015年間入戶調查世居海南省長壽老人，從調研的老人中隨機抽取36例(長壽組)，男19例，女17例，年齡100～108〔平均(102.78±1.93)〕歲。長壽組對象均接受問診及體格檢查，其認知、自理能力及常規體檢均基本正常，無患腫瘤、免疫系統疾病、結締組織病、糖尿病、心腦血管病變等器質性病變，屬于健康或基本健康者。長壽組均由本人或親屬簽署知情同意書后，采靜脈血3 ml，EDTANa2抗凝-80℃保存。為避免環境因素造成的差異，對照組選取標準為與長壽老人無親緣關系健康人群。對照組來自中國人民解放軍總醫院海南分院健康體檢中心體檢對象，共計39例，男24例，女15例，年齡40～65〔平均(46.92±5.25)〕歲。對照組均進行問診和體格檢查，其認知、自理能力及常規體檢均正常。對照組均從檢驗科采靜脈血2 ml，EDTANa2抗凝-80℃保存。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取 取EDTANa2抗凝的受試者靜脈血0.2 ml，用全基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，通過核酸定量儀測定DNA進行濃度和純度，-20℃保存。全基因組DNA提取試劑盒(貨號：51104)購自QIAGEN公司；EON核酸定量測定儀購自美國BIO-TEK公司。

1.2.2分型SNP的選擇 從HapMap數據庫(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-perl/gbrowse/hapmap3r2_B36/#search)中搜索人類SIRT1基因，確定SIRT1基因位于染色體10q21.3，用Haploview4.2軟件下載CHB(中國漢族北京)人群SIRT1基因上下游10 kb范圍內SNP位點及分型結果數據，設置最小等位基因頻率(MAF)>0.05，連鎖不平衡參數D'=1，r 2>0.8篩選SIRTI基因的Tag SNP，獲取21個SNP。根據連鎖不平衡分析選定檢測rs3740051、rs4746720、rs10997870位點，同時補充第6外顯子區非同義突變rs2273773和漢族人群長壽顯著相關的rs3758391位點，SNP位點信息見表1。

表1 中國漢族人群SNP位點信息

1.2.3PCR反應 PCR擴增反應引物序列及退火溫度見表2，PCR反應體系30 μl，包括：10倍緩沖液3 μl，dNTP 2 μl，正義鏈引物1 μl，反義鏈引物1 μl，rTaq酶0.2 μl，模板DNA 2 μl，H2O 20.8 μl。PCR反應條件為：96℃ 5 min，(96℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s)×30個循環，72℃ 10 min。PEppTC-200 PCR擴增儀購自BIO-RAD公司，TaqDNA聚合酶和dNTP購自Takara公司。

表2 PCR擴增引物與退火溫度

1.2.4PCR產物純化 按照Millipore公司96純化板操作流程操作：向96純化板孔中加入100 μl ddH2O，取出PCR產物至96純化板中室溫靜置10 min，真空抽濾泵抽 10 min至抽干，向純化板中加入40 μl ddH2O，室溫溶解10 min，取出對應的孔中的純化產物至另一96孔PCR板中。

1.2.5PCR產物測序 測序引物序列及退火溫度見表3，測序反應體系為：2 μl混合物(Bigdye3.1、5倍序列緩沖液、 H2O)，2 μl純化PCR產物，1 μl引物(5 mmol/L)。測序反應程序為：循環條件為：95℃ 15 s(95℃ 15 s，50℃ 5 s，60℃ 90 s)×35個循環，終止反應。ABI 3730XL型DNA測序儀購自Applied Biosystems公司，引物合成和基因測序均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件分析，運用Hardy-Weinberg(HW)平衡檢驗檢測樣本的群體代表性。用比數比值及其95%置信區間(95%CI)來評價相對風險。數據組間比較采用t檢驗，組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用Fisher或Pearson檢驗。

表3 測序引物與退火溫度

2 結 果

2.1HW平衡檢驗 長壽組和對照組的基因型和等位基因頻率的分布(見表4)，rs3758391、rs3740051、rs2273773、rs4746720、rs10997870均符合HW平衡(P>0.05)，故均對其基因型和等位基因頻率進行分析。

表4 SIRT1基因五個多態性位點HW平衡檢驗

2.2SIRT1基因5個SNP位點基因型與等位基因頻率 見表5。rs3758391、rs3740051、rs2273773、rs4746720和rs10997870位點的基因型頻率和等位基因頻率在長壽組和對照組間分布差異均無統計學意義(P>0.05)。

表5 SIRT1基因5個SNP位點基因型與等位基因頻率在長壽組和對照組中的分布〔n(%)〕

3 討 論

人類SIRT1基因位于染色體10q21.3，有9個外顯子，基因組序列約為33 kb，編碼747個氨基酸，相對分子量約120 kD。SIRT1通過NAD+與AMP蛋白激酶(AMPK)相互調節活性，維持細胞內的能量平衡〔8〕。在熱量限制(CR)條件下，細胞內NAD+增加，從而活化SIRT1蛋白延長壽命。白藜蘆醇(Res)可激活SIRT1蛋白并發揮模擬CR的作用，降低氧化應激和炎癥反應，延長復制性壽命〔9，10〕。

據報道SIRT1 rs4746720多態性與廣西永福長壽人群存在關聯〔11〕；rs4746720位點CC基因型可能為沈陽漢族人群衰老的危險因素，其遺傳易感性主要來自于等位基因C，而rs3758391位點和沈陽漢族健康人群衰老沒有關聯〔12〕。SIRT1基因多態性與復雜疾病之間也存在緊密關聯，SIRT1 rs4746720 CC+TT基因型存在更高的2型糖尿病發生概率〔13〕；rs4746720，rs3740051，rs1885472 位點H3(A-C-T)可能是2型糖尿病的危險因素〔14〕；rs4746720位點 CC突變基因型與老年垂體瘤患者的心理焦慮狀態存在關聯，可能促進焦慮的發生〔15〕。本研究以海南島百歲老人為研究對象，發現rs3758391、rs3740051、rs2273773、rs4746720和rs10997870等5個位點的基因型頻率和等位基因頻率在長壽組和對照組間分布均無顯著差異。本研究結果顯示海南地區長壽人群與SIRT1基因多態性在統計學上無顯著性差異。但通過分析SIRT1基因10 kb區域內SNP位點的連鎖不平衡性，檢測包含該區域內的所有常見SNP的5個標簽SNP，明顯提高了研究效率。如果在此基礎上加大樣本量，同時比較多種復雜性疾病與SIRT1 基因型頻率之間的關系，對于解讀海南獨特條件下的長壽遺傳因素會有新的發現。