藏藥十八味訶子利尿丸對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

梁沛余 段路路 吳 穹

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

十八味訶子利尿丸，藏藥名為金尼阿如久杰日布，處方源自《藏醫(yī)醫(yī)訣補(bǔ)遺》，收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》(編號(hào)：WS3-BC-0182-95)，是由訶子、余甘子、姜黃、金礞石等十八味藥材經(jīng)研磨、過篩、泛丸、干燥等藏醫(yī)傳統(tǒng)制藥工藝炮制而成的復(fù)方制劑，有利尿、降糖等功效〔1〕，其構(gòu)成藥材中，紅花、小檗皮、蒺藜、余甘子、姜黃、熊膽、牛黃、巴夏嘎等八種藥材現(xiàn)已有科學(xué)研究〔2〕證實(shí)對(duì)腦缺血損傷有一定的保護(hù)作用，其余藥材如訶子、刺柏等亦有抗氧化效能的報(bào)道，但此藥目前在臨床上主要應(yīng)用于腎病、糖尿病等癥，科學(xué)研究方面亦僅有在成分質(zhì)量分析、抗菌效能等〔3〕領(lǐng)域的數(shù)篇報(bào)道，尚無(wú)對(duì)腦缺血損傷的藥效學(xué)及機(jī)制的研究。本實(shí)驗(yàn)擬觀測(cè)十八味訶子利尿丸預(yù)處理對(duì)模型大鼠多項(xiàng)指標(biāo)的影響，證實(shí)十八味訶子利尿丸有對(duì)抗腦缺血/再灌注損傷的作用并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及分組 SD大鼠80只，雄性，質(zhì)量(260±20)g，清潔級(jí)，購(gòu)自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)：SCXK(甘)2009-0004，于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF 級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。動(dòng)物隨機(jī)等量分為藏藥組、西藥組、模型組及假手術(shù)組。

1.2藥品與試劑、儀器 十八味訶子利尿丸(青海省格拉丹東藥業(yè)有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma公司)；其他試劑均由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室提供。BP110S型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；721型分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司)。

1.3方法

1.3.1預(yù)處理 藏藥組給予十八味訶子利尿丸(300 mg·kg-1·d-1)干預(yù)，西藥組給予尼莫地平(10.8 mg·kg-1·d-1)干預(yù)，模型組與假手術(shù)組均給予等量0.9% NaCl溶液干預(yù)，連續(xù)灌胃給藥10 d。

1.3.2造模 末次給藥2 h后，應(yīng)用加長(zhǎng)栓線的新式Zea Longa線栓法建立大腦中動(dòng)脈閉塞再灌大鼠模型〔4〕。大鼠全麻(水合氯醛腹腔注射)后固定，頸部于正中位做3 cm切口，小心剝離右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸總動(dòng)脈(CCA)，行CCA、ECA結(jié)扎。夾閉ICA，在ICA與ECA呈“Y”形分叉處剪切口，將加長(zhǎng)線栓(60 mm，常規(guī)為40 mm)插入并開放ICA，調(diào)整栓線角度，緩慢推入顱內(nèi)，直至有明顯阻力后停止推進(jìn)。假手術(shù)組除栓線不推入ICA外，其余操作與其他三組完全一致。記錄栓線入顱時(shí)間，2 h后拔出栓線實(shí)現(xiàn)再灌注。

1.4指標(biāo)測(cè)定

1.4.1行為學(xué)測(cè)定 缺血2 h再灌注2、12、24 h后按照Bederson等〔5〕建立的5分評(píng)分法對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。

1.4.2腦含水量測(cè)定〔6，7〕缺血2 h再灌注24 h后，各組隨機(jī)取6只大鼠冰盤上斷頭取腦，計(jì)算腦組織含水量百分比。

1.4.3腦梗死灶面積〔8，9〕測(cè)定及海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)觀察 缺血2 h再灌注24 h后，各組隨機(jī)取6只大鼠冰盤上斷頭取腦，冠狀位切成5片，取第1、2、3、5腦片行TTC染色，計(jì)算腦梗死灶面積百分比；取第4腦片行硫堇染色，觀察海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)變化，計(jì)數(shù)存活神經(jīng)元。

1.4.4腦組織SOD活性及MDA含量的觀測(cè) 缺血2 h再灌注24 h后，各組取余下8只大鼠，冰盤上取右側(cè)腦組織，勻漿，離心，取上清液按說明書測(cè)定腦組織中SOD活性及MDA含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠不同灌注時(shí)間神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比較 在不同灌注時(shí)間，與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分均明顯升高(均P<0.05)，十八味訶子利尿丸及西藥尼莫地平均可降低此效應(yīng)(均P<0.05)，見表1。

2.2各組腦組織含水量及梗死灶面積比較 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織發(fā)生水腫、梗死(均P<0.05)；十八味訶子利尿丸預(yù)處理及西藥尼莫地平均可顯著減輕腦組織梗死程度(P<0.05)，可緩解腦組織水腫，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3各組海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)觀測(cè)結(jié)果比較 見圖1，與假手術(shù)組〔(89.83±11.60)個(gè)/視野〕比較模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞體結(jié)構(gòu)被破壞，神經(jīng)元發(fā)生固縮壞死，存活神經(jīng)元數(shù)量明顯下降〔(39.00±9.63)個(gè)/視野，P<0.05〕；十八味訶子利尿丸預(yù)處理和西藥尼莫地平組均可減輕建模損害，對(duì)抗神經(jīng)元胞體損傷，增加神經(jīng)元的存活量〔(59.67±8.55)個(gè)/視野，P<0.05〕。

表1 不同灌注時(shí)間神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比較(分，

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組腦組織含水量、梗死灶面積比較

圖1 各組海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)比較(硫堇染色，×200)

2.4各組腦組織SOD活性及MDA含量比較 如表3所示，與假手術(shù)組比較，模型組腦組織SOD活力降低，MDA的生成增加(均P<0.05)，致使神經(jīng)元損傷；十八味訶子利尿丸預(yù)處理及西藥組均可提高腦組織抗氧化能力(均P<0.05)，減輕自由基損害。

表3 各組腦組織SOD活性、MDA含量比較

3 討 論

腦缺血/再灌注損傷過程涉及多種復(fù)雜機(jī)制，可誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生凋亡〔10〕、壞死、自噬等病理生理改變，最終對(duì)腦功能造成不可逆損傷。氧化應(yīng)激與腦缺血/再灌注損傷關(guān)系密切〔11〕，干預(yù)氧化應(yīng)激〔12〕阻止病程進(jìn)展已成為該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。腦缺血/再灌注損傷過程中，磷脂酶A2活化，大量自由基生成，且腦SOD活力水平處于低值狀態(tài)，不能對(duì)其進(jìn)行有效的清除，最終造成自由基積聚及MDA生成增加。自由基可致血管反應(yīng)性改變，損傷血腦屏障與血管內(nèi)皮細(xì)胞，還可致膜上的磷脂被降解，失去其原有生物學(xué)功能，促使神經(jīng)元固縮凋亡，這與自由基可在膜上發(fā)生過氧化反應(yīng)關(guān)系緊密。

自由基可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，其過程與caspase、Bcl等蛋白家族關(guān)系密切。目前認(rèn)為自由基誘導(dǎo)凋亡的主要途徑有：①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑：腦缺血/再灌注損傷可活化神經(jīng)元胞內(nèi)眾多酶類，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)，腦損傷生成的大量自由基亦參與到此過程中。在眾多因子的作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于持續(xù)應(yīng)激狀態(tài)，調(diào)控caspase等凋亡蛋白家族的表達(dá)，促使神經(jīng)元凋亡。②線粒體途徑:腦缺血/再灌注損傷時(shí)，線粒體呈現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)，大量自由基由此產(chǎn)生，造成線粒體蛋白翻譯改變、內(nèi)切酶被活化、多種水解酶被激活，致使細(xì)胞色素C氧化酶處于低水平，從而介導(dǎo)caspase等凋亡蛋白家族的活化，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。此外，自由基提升線粒體DNA突變率及對(duì)呼吸鏈的直接攻擊亦是影響凋亡的重要原因。③死亡受體通路:腦缺血/再灌注損傷時(shí)，自由基可通過調(diào)節(jié)NF-κB、Fas/FasL等〔13〕通路，促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡。因此，提高SOD活力水平〔14〕，防止自由基集聚，減少M(fèi)DA在氧化應(yīng)激下的生成，尋找干預(yù)氧化應(yīng)激的新藥物，對(duì)阻止腦缺血/再灌注損傷進(jìn)程意義重大。

十八味訶子利尿丸為傳統(tǒng)藏藥制劑，其構(gòu)成藥材中的八種以上現(xiàn)已有科學(xué)研究證實(shí)對(duì)腦缺血損傷有一定的保護(hù)作用，其余藥材如訶子、刺柏等亦有抗氧化效能的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，十八味訶子利尿丸預(yù)處理可降低腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分、梗死灶面積，減輕神經(jīng)元變性，增加神經(jīng)元存活數(shù)量，證實(shí)十八味訶子利尿丸可對(duì)抗腦缺血/再灌注損傷；十八味訶子利尿丸預(yù)處理可使大鼠腦組織中SOD活性水平提高，MDA生成下降，防止自由基積聚，削減自由基對(duì)腦組織的負(fù)性作用，說明其對(duì)腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制與提高機(jī)體抗氧化能力關(guān)系密切。但由于腦缺血/再灌注損傷機(jī)制極為復(fù)雜，故其保護(hù)效能的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。