百香果果汁對衰老小鼠學習記憶、抗氧化的影響及其機制

韋家河 馮 霞 吳開慧 馮 潔 農生斌 韋玲林 韋 妮 焦 雯 黃彥峰

(右江民族醫學院，廣西 百色 533000)

我國老齡人口眾多，抗衰老的研究尤為重視。百香果是西番蓮科多年生木質藤本植物果實的通稱，食用和藥用價值兼備，主要用于制備果汁，大量食用也不易引起毒性反應，有較高的安全邊際〔1〕。有研究表明，百香果中富含有機酸、不飽和脂肪酸和人體必需脂肪酸等，具有鎮靜、抗癲癇、降血糖、降血脂和抗氧化等功效〔2～5〕。本實驗擬分析百香果果汁對衰老小鼠學習記憶、抗氧化能力的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1一般資料 昆明種健康小鼠，雌雄各半，體重(25±3)g，右江民族醫學院實驗動物中心提供(動物生產許可證號：SCXK桂2012-0003)。百香果(廣西百色市售)；D-半乳糖(美國Amresco公司)；維生素C(遂成藥業股份有限公司國藥準字 H4103317)。考馬斯亮藍蛋白、一氧化氮(NO)、NO合酶(NOS)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒均為南京建成生物工程研究所提供。離心機(上海安亭科學儀器廠)；FSH-2A可調高速電動勻漿機(金壇市金南儀器廠)；電子天平〔梅特勒-托利儀器(上海)有限公司〕；電熱恒溫水溫箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)； 722 型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；BA-6小鼠測試避暗儀、DT-6小鼠跳臺測試儀(均為成都泰盟科技有限公司生產)。

1.2百香果汁的制備 取鮮果去皮后榨汁，再用4層紗布過濾，濾出的原汁為高濃度劑量組，用蒸餾水將原汁稀釋一倍為中濃度劑量組，再將中濃度的果汁稀釋一倍為低濃度劑量組，冰箱冷藏，用時恢復至室溫。

1.3動物分組及喂養 小鼠48只，雌雄各半，同室分籠喂養。適應喂養5 d按體重隨機分為正常組、模型組、陽性組、百香果高、中、低劑量組。每天下午加滿料塊及飲水，并于次日早上檢查，補充料塊及飲水。溫度18～22℃，相對濕度50%～70%。

1.4模型復制及給藥 臨用前將D-半乳糖配制成10%生理鹽水溶液，正常組每日腹腔注射等體積0.9%NaCl溶液，其余各組每日均按100 mg/kg腹腔注射D-半乳糖，1次/d，連續42 d。腹腔注射的同時，百香果治療組分別按高、中、低劑量，陽性組按100 mg/kg灌胃維生素C，正常組和模型組灌胃等量生理鹽水。

1.5學習記憶能力的測試

1.5.1跳臺實驗 給藥第40天進行跳臺實驗，打開小鼠跳臺測試箱,把小鼠放入跳臺儀中,再通 36 V 交流電,動物受到電擊,其逃避反應即為跳上平臺。多數動物會再次或多次跳至銅柵上,受電擊后又迅速跳回平臺,訓練5 min,記錄每只小鼠受電擊的次數作為學習成績(EN1)。第41天,在通電下,直接將小鼠置于平臺上,記錄從小鼠放上平臺到第1次跳下的時間為潛伏期(LT);小鼠受電擊后會逃避性的跳上平臺,然后記錄5 min內小鼠再次跳下的次數(EN2)為錯誤次數，LT和EN2共同作為記憶成績。

1.5.2避暗反應實驗 避暗儀暗室底部銅柵通36 V、50 Hz交流電，先把小鼠放入避暗儀反應箱中訓練3 min，小鼠受電擊逃往明室。測試開始時，將小鼠頭部背對洞口放入明室，進入暗室則受到電擊，避暗儀自動記錄5 min 內小鼠進入暗室的次數，即為錯誤次數，首次進入暗室的時間為避暗LT。采用多次測試法：第40天上午9∶00 開始訓練實驗，當日下午15∶00，次日上午9∶00 和第42天上午9∶00(訓練實驗48 h后)分別測試3次，取平均值記錄5 min內小鼠避暗LT和錯誤次數，以此反映小鼠的記憶能力。

1.6各臟器指數測定 各組灌胃給藥結束且完成行為學測試后，頸椎脫臼處死小鼠，在冰面上取腦、胸腺、心、肝、腎和脾，冰生理鹽水沖洗干凈后濾紙吸干，分析天平準確稱量其濕重，各臟器指數=臟器濕重(mg)/體重(g)。

1.7生化指標測定 稱重后的腦組織用冰凍生理鹽水按1∶9制備10%的組織勻漿，以3 500 r/min離心15 min后取上清液，嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.8統計學方法 使用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1百香果果汁對小鼠一般情況的影響 造模30 d后,百香果中濃度組毛色光滑,行動活躍，反應靈敏與正常組相近，其余實驗組毛色發黃,無光澤,皮膚松弛,行動緩慢,精神萎靡，容易抓取。

2.2各組體重比較 實驗開始后各組體重都有所增長，但各組差異無統計學意義(P>0.05)，第28天，模型組和百香果各濃度組較前1 w下降，但差異無統計學意義(P>0.05)；第42天，模型組明顯低于正常組(P<0.01)，陽性組與百香果中濃度組明顯高于模型組(P<0.01,P<0.05)，見表1。

2.3各組臟器指數比較 與正常組比較，模型組腦、心、肝、胸腺、腎及脾指數明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，各組腦、胸腺、腎臟指數均保持較高水平，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，陽性組、百香果高、低濃度組心、肝指數也保持較高水平，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表1 各組體重比較

與模型組比較:1)P<0.01；2)P<0.05

表2 各組臟器指數比較

與正常組比較：1)P<0.01;與模型組比較：2)P<0.05,3)P<0.01

2.4各組學習記憶比較 與正常組比較，跳臺實驗和避暗實驗模型組LT明顯縮短，錯誤次數明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，跳臺實驗中百香果低濃度組LT差異無統計學意義(P>0.05)，其余各組LT明顯增加，錯誤次數明顯減少(P<0.01)，避暗實驗中，各組LT均明顯增加，錯誤次數明顯減少(均P<0.01)。見表3。

表3 各組學習記憶比較

與正常組比較:1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

2.5各組腦組織生化指標比較 與正常組比較，模型組CAT活力、GSH含量、SOD活性均顯著下降(P<0.01)，NO含量、NOS活力、MDA含量和AchE活性顯著上升(P<0.05，P<0.01)；與模型比較，陽性組、百香果中、低濃度組CAT活力、GSH含量和SOD活性均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，NO含量、MDA含量和AchE活性明顯下降(P<0.05，P<0.01)，百香果高濃度組SOD 活性也顯著升高(P<0.01)，NOS活力、MDA含量和AchE活性明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表4 百香果果汁對小鼠腦組織生化指標的影響

與正常組比較:1)P<0.05；2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05；4)P<0.01

3 討 論

衰老是一種正常的生理現象，伴隨著一系列全身性、多方面的退行性變化。小鼠腹腔注射D-半乳糖造模方式簡便,周期較短，結果穩定，節省時間及資金,是目前國內應用較多的衰老模型，被廣泛應用于腦老化、抗衰老研究〔6，7〕。本實驗結果與相關研究結果相近〔8，9〕。跳臺實驗是用來評價實驗動物學習記憶能力的經典研究方法。本實驗結果說明百香果果汁對小鼠學習記憶有改善作用。

D-半乳糖致衰老模型主要通過氧化應激積累積體內MDA含量,降低SOD和GSH-Px的活性引起〔10〕。張常娥等〔11〕研究表明D-半乳糖致衰老的主要機制是氧自由基引起的過氧化損傷，其在體內代謝過程中產生超氧陰離子自由基和過氧化氫(H2O2)，對機體造成損傷。CAT、SOD和GSH都是體內重要的抗氧化劑，可以有效降低機體活性氧類和過氧化物的生成，間接反映機體清除自由基、保護機體免受自由基損傷的能力，CAT和GSH可清除H2O2,MDA是脂質過氧化的代謝產物，反映機體脂質過氧化水平，代表組織氧化損傷程度〔12〕。本實驗結果說明百香果果汁夠提高機體內各種抗氧化系統相關酶活性，減輕機體過氧化損傷程度從而延緩衰老。

NO是神經傳導的逆信使，在學習記憶中發揮重要作用，NOS是NO產生的關鍵酶,兩者的水平呈正相關，NO產生過多則引起腦功能衰退,AchE是乙酰膽堿(Ach)的分解酶，其活力可間接反映Ach的含量和膽堿能神經功能的情況，老年人體內單胺類神經遞質和膽堿能神經遞質的減少直接導致老年癡呆的形成〔13，14〕。本實驗結果顯示，百香果果汁能夠顯著降低腦AchE活性、NO和NOS水平，從而保護膽堿神經功能，減輕NO對神經細胞的毒性，起到改善小鼠學習、記憶能力的作用，其機制可能是抑制AchE活性，提高乙酰膽堿轉移酶和乙酰膽堿M受體表達量，進而維持腦內乙酰膽堿水平穩定。

綜上，百香果果汁可以改善衰老小鼠學習記憶能力，提高腦組織的抗氧化能力，有較好延緩衰老的作用，其機制可能與清除機體過多自由基、提高機體抗氧化能力、減輕NO對神經細胞的毒性等有關。