ApN/TNF-α信號途徑在有氧運動防治ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化過程中的抗炎癥作用

吳衛東

(鄭州大學體育學院，河南 鄭州 450044)

動脈粥樣硬化(AS)是一種常見的動脈血管疾病，嚴重威脅人類健康，其所致的心、腦血管疾病發病率和死亡率居各種疾病前列。AS病變特點是動脈管壁增厚變硬，管腔縮小并失去彈性，動脈內膜上聚集呈黃色粥樣的脂質，主要累及彈性及大中等肌性動脈，一旦發展到阻塞動脈管腔，則導致動脈所供應的組織或器官缺血、壞死〔1〕。脂聯素(ApN)是脂肪細胞分泌產生的一種內源性生物活性多肽或蛋白質，是脂肪組織基因表達最豐富的蛋白產物之一。ApN與AS的發生發展密切相關，可多方位抑制AS性細胞改變。正常人血液中ApN水平顯著高于AS患者〔2〕，所以AS的發生發展可能與血液中ApN水平的下降關系密切，同時對動物的研究發現ApN基因缺陷小鼠在血管受損后內膜較野生型小鼠明顯增厚〔3〕。血清ApN水平不僅能預示AS的發生發展，并且在臨床上表現出抗AS的作用，因此通過提高ApN mRNA表達和血清水平已經成為防治AS的一種新手段〔4,5〕。現有研究證實長期慢性炎癥是導致AS的重要因素，其實質是動脈壁內皮細胞、平滑肌細胞損傷后的炎性纖維組織增生反應〔6〕。AS斑塊中的巨噬細胞和泡沫細胞可以通過分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α擴大血管壁的炎性反應，增加白細胞聚集，從而刺激血管黏附分子(VCAM)-1 mRNA表達增加，使內皮組織黏附更多的單核細胞，黏附的單核細胞還可移入內膜進一步轉化為具有強氧化能力的巨噬細胞〔7〕。改變靜態生活方式，適宜運動(有氧運動)是預防AS的有效手段，但關于運動預防AS的確切機制尚未完全闡明。本研究以ApoE-/-小鼠為動物模型，通過觀察小鼠運動干預后主動脈血管壁結構的病理變化，探討有氧運動在防治AS過程中ApN通過主動脈脂聯素受體(AdipoR)1、TNF-α信號通路發揮抗炎癥作用的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及方案 8周齡雄性ApoE-/-小鼠20只以二級條件飼養,小鼠購于北京大學醫學部實驗動物部〔合格證號：scxk(京)2006-2008〕，適應性飼養1 w后隨機分為對照組(C)和運動組(E)，每組10只，兩組小鼠均飼以高脂膳食飼料(21%豬油，0.15%膽固醇，78.85%普通飼料)〔8〕。E組小鼠每日上午9～10時進行跑臺運動，遞增運動強度和時間，每周5次〔9〕。小鼠由第1～5周 10 m/min，30 min，逐漸遞增至13 m/min，60 min，并穩定此運動量至14周末。

1.2取材 運動結束后所有小鼠麻醉，心尖取血，制備血清。心臟血管在體經焦碳酸二乙酯(DEPC)水灌流后取出全心臟和主動脈，取附睪、腎周脂肪墊和腓腸肌，DEPC水沖洗，用濾紙吸干后稱重。取材前E組小鼠停止運動48 h，禁食過夜。

1.3測試指標和方法 主動脈病理觀察：全心臟標本經4%多聚甲醛固定4 h，然后聚乙二醇和聚乙二烯醇的水溶性混合物(OCT)包埋進行冰凍切片，切片厚度10 μm并進行蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察主動脈病理形態。血清ApN含量測定：雙抗夾心酶聯免疫(ABC-ELISA)方法，試劑盒購于美國R&D公司。ApN mRNA測定：采用RT-PCR法檢測。Trizol一步法提取總RNA，采用兩步法反轉錄試劑盒進行反轉錄，試劑盒由美國Amresco公司提供，循環30次。引物序列檢索自NCBI-Nucleotide數據庫，采用Primer5.0軟件設計，由上海生工生物工程技術公司合成，ApN上游引物：5′-AATCATTATGACGGCAGCAC-3′，下游引物：5′-CCAGATGGAGGAGCACAGAG-3'；β-actin擴增產物長度511 bp，上游引物5′-CCATCTACGAGGGCTATGCT-3'，下游引物5'-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAA-3'。主動脈AdipoR1、TNF-α蛋白測定：采用Western印跡方法檢測。取100 mg腓腸肌充分剪碎加入裂解液，勻漿后離心(16 000/min，30 min)取上清液，測定蛋白濃度。調整上樣量后，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳分離，用濕轉法將目的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗滌后加一抗(抗體分別購自美國Abcam公司和Santa cruz公司)4℃過夜。封閉-洗滌緩沖液(TBST)沖洗3次，加堿性磷酸酶標記的二抗1∶3 000稀釋液孵育1 h后顯色，以各細胞因子與β-actin的比值作為相對表達量。

1.4統計學分析 采用SPSS14.0數據軟件包進行t檢驗。

2 結 果

2.1體重及體成分 根據附睪脂肪墊和腎周脂肪墊重量與體重的計算出的脂體比是反映機體內脂肪含量的指標。C、E兩組小鼠絕對體重無顯著變化〔分別為(37.25±2.40)g、(36.71±2.69)g〕，脂體比E組(2.53±0.38)小鼠顯著低于C組小鼠(3.64±0.49，P<0.05)，表明長期有氧運動雖未顯著影響ApoE-/-小鼠AS形成過程中的體重，但顯著減少了小鼠內臟脂肪積累，改善了脂體比。

2.2主動脈血管壁病理觀察 C組小鼠主動脈血管壁纖維板分裂出現間隙，呈多層狀，內膜增厚且失去原有的波浪狀，鏡下可見泡沫細胞浸潤和纖維斑塊，甚至斑塊有破裂出血，內膜被淋巴細胞、炎性細胞浸潤，可見大量膽固醇結晶，顯示出易損斑塊的特征。E組小鼠主動脈血管壁彈力纖維排列相對C組小鼠致密，內膜輕度增厚，偶有斷層，可見少量脂質斑塊和泡沫細胞，病變程度較C組明顯減輕，見圖1，表明有氧運動對ApoE-/-小鼠AS的發生、發展具有明顯的抑制和延緩作用。

圖1 各組小鼠主動脈竇橫截面HE染色觀察(×100)

2.3脂肪組織ApN mRNA和血清ApN含量 E組小鼠脂肪組織ApN mRNA表達(1.92±0.10)及血清水平〔(0.59±0.07)mg/L〕顯著高于C組小鼠〔(1.23±0.11)、(0.43±0.05)mg/L，P<0.05〕。表明有氧運動可以顯著提高ApoE-/-小鼠脂肪組織ApN mRNA的表達和血清ApN水平。

2.4主動脈AdipoR1、TNF-α蛋白表達 E組小鼠主動脈AdipoR1蛋白顯著高于C組〔(1.31±0.15)vs(0.98±0.11)，P<0.05〕，E組小鼠主動脈TNF-α蛋白顯著低于C組〔(0.92±0.09)vs(1.15±0.10)，P<0.05〕，見圖2，表明有氧運動顯著提高了主動脈AdipoR1蛋白表達，抑制了主動脈TNF-α蛋白表達。

圖2 Western印跡檢測主動脈AdipoR1、TNF-α蛋白表達

3 討 論

本研究發現有氧運動對已形成的AS病變有一定延緩作用，但有氧運動并不能逆轉已形成的AS。載脂蛋白(Apo)E的缺失會導致循環血液中膽固醇的積累而誘發AS〔8〕，ApoE-/-小鼠就是利用基因敲除技術，造成血液中膽固醇清除困難而不需要高脂飲食就會自發形成AS，且產生的AS斑塊，病變位置、病變過程與人類極為相似〔10,11〕。

ApN mRNA表達水平受多種因素影響，例如年齡、性別和環境等，運動是大量影響因素中重要的一個。有氧運動一旦確定合適的研究對象且制定有效的運動強度、采用適宜的運動方式和控制合理的運動時間就可以顯著提高ApN mRNA表達水平。ApN是脂肪組織合成分泌的細胞因子，但人體不同部位脂肪組織ApN含量和分泌存在顯著差異，影響ApN水平的主要因素是內臟脂肪組織〔12,13〕，然而ApN基因表達水平隨內臟脂肪組織減少而升高。本實驗結果提示有氧運動雖未顯著改變小鼠的絕對體重，但可以有效控制其內臟脂肪積累，同時有氧運動可以顯著提高小鼠脂肪組織ApN表達和血清ApN含量，這可能是有氧運動通過減少內臟脂肪積累而增強了脂肪組織ApN的合成與分泌。分析其機制一方面可能是炎癥因子TNF-α的表達量隨內臟脂肪組織減少而降低，從而解除了TNF-α的高表達對ApN mRNA表達的抑制；另一方面可能是模型組小鼠外周的保護性消耗增多，同時代償性下降導致了ApN水平低于運動組小鼠。

本實驗發現有氧運動增強了小鼠主動脈AdipoR1蛋白的表達，降低了TNF-α蛋白的表達水平，提示有氧運動可能通過增強ApN活動水平抑制了主動脈TNF-α介導的炎癥反應。炎癥反應在AS的發生、發展過程中發揮著重要作用，血管壁最初的炎癥反應是通過炎癥細胞的增生達到保持機體內環境穩定的目的，從而實現對血管損傷的保護，但是血管壁炎癥如不能及時消除則會對內皮組織和血管造成破壞，引發斑塊破裂及血栓等并發癥〔14,15〕。TNF-α的激活是炎癥激活的重要步驟之一，是炎癥反應過程中的關鍵調節因子，參與了眾多心血管疾病的發生和發展〔16〕。內皮細胞被TNF-α激活后可增強單核細胞的黏附，這是血管性疾病發生發展的關鍵性步驟〔17〕。ApN可通過調節內皮細胞的炎癥反應發揮抗AS的作用，分析其機制可能有以下兩方面：一是ApN與主動脈AdipoR1結合后可增加周圍組織的胰島素敏感性。胰島素敏感性的增加可以阻斷TNF-α誘導NF-κB抑制蛋白磷酸化及NF-κB的激活，從而抑制黏附分子的表達，發揮保護血管壁和延緩AS斑塊發展的作用；二是ApN與主動脈AdipoR1結合后可抑制主動脈白細胞介素(IL)-6的表達。炎癥因子IL-6可以誘導內皮細胞產生急性反應蛋白，對宿主自身破壞性炎癥有增強作用；IL-6還可進一步激活主動脈TNF-α信號系統，從而形成正反饋的級聯放大效應，使炎癥反應加強〔18〕。由此推測，有氧運動通過ApN抑制IL-6表達阻斷了TNF-α信號途徑，減少了相關炎癥因子的表達，發揮了保護主動脈的作用。