心肌缺血小鼠牛磺酸代謝和保護作用的分子機制

張增雷 劉 星 胡 靜 杜書迪 任鳳云

(牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011)

心肌缺血會對機體心臟產生很多不良的后果，造成的直接后果是降低其心肌細胞有氧代謝功能，減少其產能，使心臟活動時所需的能量供應減少，甚至會產生心律失常及心力衰竭〔1,2〕。盡管目前臨床上的再灌注手段可以在一定程度上緩解心肌缺血及頓抑心肌，但已經造成的損傷心肌的修復困難及缺血再灌注造成的新的心肌損傷導致再灌注治療的部分病人依然產生心力衰竭和左心室重構〔3,4〕。因此在進行再灌注治療之前采取心肌保護藥物治療可能會產生協同的效果〔5〕。牛磺酸(Taurine)屬于一類β-氨基酸旳亞磺酸類似物，屬于機體內含量最高的游離氨基酸〔6〕。牛磺酸對于機體的許多組織及細胞都存在一定程度的保護作用〔7,8〕。研究發現牛磺酸一般是通過抑制細胞凋亡、減少脂質過氧化損傷、穩定細胞膜、調控細胞滲透壓、清除氧自由基及維護細胞內穩態等作用機制，從而產生保護缺血所引發的心肌損傷、避免動脈粥樣硬化和調控血壓的作用〔9,10〕。目前在心肌缺血的病理狀態下，心肌細胞內牛磺酸的代謝和保護作用的分子機制的研究較少。本研究探討牛磺酸對2型糖尿病大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 健康雄性昆明種小鼠30只，體質量18～22 g，由中國實驗動物中心提供(購于武漢醫學科學院實驗動物中心)。隨機分為模型組(異丙腎上腺素2 mg· kg-1· d-1，ip.，西南藥業股份有限公司)、正常對照組(生理鹽水，10 ml·kg-1·d-1，ig.)、牛磺酸組(牛磺酸，400 mg· kg-1·d-1，ig.，蘇州弘森藥業有限公司)，每組10只。

1.2小鼠心肌缺血模型的建立 各組分別采取劑量(0.1 ml/10 g)灌胃預防給藥，1次/d，連續1 w。第5天除正常對照組外，其余各組預防給藥30 min后，腹腔注射0.02%的異丙腎上腺素(ISO)造模，正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，1次/d，連續3 d。末次給藥后1 h，小鼠眼球采血處死，將血清分離待測。

1.3生化指標測定 造模12 h和3 d，小鼠眼球采血，取血2 ml到試管中，離心3 000 r/min 15 min后，提取上清液，對小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量進行測定。采用鄰苯三酚比色法對SOD活性進行測定，采用硫代巴比妥比色法對MDA含量進行測定。

1.4心肌含水量(MWC)及心肌指數(MI)的測定 取血完成后，處死小鼠快速取出完整心臟，在冰的生理鹽水中清洗淤血后，將大血管及結締組織進行去除，采取濾紙將水分吸干后，稱取其濕重。然后放到干燥箱中，在110℃下干烤8 h后，再稱取其干重。MWC=(濕重-干重)/濕重×100%;MI=濕重/體重×100%。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測小鼠白細胞介素(IL)-6、C反應蛋白(CRP)的水平 采取空白孔調零，酶標儀對450 nm處的OD值進行測定。以標準品OD值為橫坐標，IL-6以濃度0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/μl為縱坐標，CRP以濃度0、5、10、20、50、100 ng/μl為縱坐標。制作標準曲線采取軟件Curve Expert1.3。根據樣品的OD值采取Excel WPS計算相應濃度。

1.6Western印跡檢測相關蛋白的表達 取液氮凍存好的小鼠心肌組織，將其研磨成粉末，充分裂解30 min后，在4℃的條件下進行15 000 r/min離心20 min，提取上清，根據聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白活性測定試劑盒(增強型)(碧云天生物技術研究所)對蛋白定量進行測定。將30 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將電泳分離好的蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫條件下在5%脫脂牛奶中進行反應1 h，充分洗滌后分別添加一抗小鼠抗人胞TAUT單克隆抗體(1∶1 000)，兔抗鼠半胱氨酸雙加氧酶(CDO)多克隆抗體(1∶1 000)及兔抗人半胱氨酸亞磺酸脫羧酶(CSD)單克隆抗體(1∶1 000)后，在4℃的條件下反應過夜，充分洗滌后添加二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)或者HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)，在室溫條件下反應30 min，充分洗滌后，采取電化學發光(ECL)反應1 min，采用全自動數碼凝膠圖像分析系統進行拍照觀察。

1.7統計學分析 采用SPSS20.0統計軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組血清SOD活性及MDA含量的比較 模型組、牛磺酸組與正常對照組比較，血清總SOD活性明顯下降，MDA含量明顯上升(P<0.05)。牛磺酸組與模型組相比，血清總SOD活性明顯升高，MDA含量明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清SOD活性及MDA含量的比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2各組心肌MWC比較 與正常對照組比較，模型組及牛磺酸組MWC明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，牛磺酸組MWC顯著減少(P<0.05)，對模型組增加部分的抑制率達71.05%，見表2。

2.3各組MI比較 與正常對照組比較，模型組及牛磺酸組MI明顯提升(P<0.05)。與模型組比較，牛磺酸組MI明顯降低(P<0.05)，對模型組增加部分抑制率為75.29%，見表2。

表2 各組MWC、MI比較

2.4各組細胞因子IL-6、CRP比較 與正常對照組比較，模型組及牛磺酸組各時間段IL-6、CRP表達水平明顯提升(P<0.05)。與模型組比較，牛磺酸組IL-6、CRP表達水平顯著降低(P<0.05)，見表3和表4。

表3 各組細胞因子IL-6水平比較

表4 各組細胞因子CRP水平比較

2.5各組心肌組織TAUT、CDO和CSD表達比較 與正常對照組比較，模型組和牛磺酸組心肌組織TAUT的表達下調；與模型組比較，牛磺酸組心肌組織TAUT蛋白的表達上調。與正常對照組比較，模型組和牛磺酸組心肌組織CDO及CSD蛋白的表達上調；與模型組比較，牛磺酸組心肌組織CDO及CSD蛋白的表達下調，見圖1。

圖1 蛋白質印跡法檢測心肌組織TAUT、CDO、CSD表達水平

3 討 論

心肌缺血一般都會導致缺氧，缺氧直接導致心肌細胞有氧代謝功能降低〔11〕。大劑量ISO可引起心肌收縮力提升，心率加快，心肌耗氧顯著高于供氧，從而引發心肌缺血〔12,13〕。目前研究認為ISO誘導的心肌損傷和心肌相對缺血缺氧、膜通透性變化、心肌細胞產生水腫及氧自由基損傷等具有不同程度的關系〔14〕。SOD屬于一種自由基清除酶，其活性的高低反映機體清除自由基的能力，MDA屬于脂質過氧化反應的關鍵終產物，對其含量進行測定能夠間接反映機體中自由基水平和脂質過氧化反應程度〔15〕。

牛磺酸屬于細胞保護劑，存在清除自由基及抗脂質過氧化的作用，能夠緩解由于缺氧導致的心肌細胞壞死，對心肌缺血損傷具有較佳的保護作用〔16,17〕。本實驗結果說明心肌缺血導致小鼠的心肌細胞膜結構受到損傷，心肌細胞產生水腫。牛磺酸有較佳的保護心肌細胞膜結構及改善心肌水腫的效果，牛磺酸可能通過提升心肌組織清除氧自由基能力，抑制心肌組織脂質過氧化物生成等作用機制來緩解心肌缺血損傷。

炎性細胞因子IL-6和CRP為十分常見的炎癥細胞因子，對心功能障礙的發生發展具有關鍵作用。臨床上一般將測定血清IL-6和CRP的水平作為評估心肌損傷病人病情嚴重程度的關鍵參考指標〔18,19〕。本實驗說明牛磺酸能夠明顯降低炎性細胞因子IL-6及CRP的水平，從而緩解由于炎性介質介導的損傷，進而可能起到心肌保護效果。

TAUT一般存在于細胞膜上，TAUT對于保持細胞內牛磺酸的濃度具有十分關鍵的作用。在CDO的作用下，半胱氨酸能夠產生半胱氨酸亞磺酸，而半胱氨酸亞磺酸在CSD和P5P旳作用下，產生連二亞硫酸，最終在連二亞硫酸脫氧酶的作用下產生牛磺酸〔20,21〕。CDO及CSD在牛磺酸的合成過程中具有十分關鍵的作用〔22〕。本文結果證實了在心肌缺血及缺氧的狀況下，心肌細胞表面TAUT表達數量的下調抑制了牛磺酸向心肌細胞內的轉運，牛磺酸能夠提升了心肌細胞內TAUT蛋白的表達水平，促進TAUT從胞質入核，與TAUT基因上游啟動子區的TonE結合，上調TAUT蛋白的表達，抑制了CDO和CSD蛋白的表達，從而導致牛磺酸向心肌細胞內的轉運明顯增加。

綜上，牛磺酸對小鼠心肌缺血具有保護作用，其作用機制可能是提升氧自由基清除系統活性，減少脂質過氧化，上調TAUT的表達，下調CDO及CSD蛋白的表達，從而發揮其對心肌缺血的細胞保護作用。