莪術水提物通過上調notch1誘導口腔癌細胞凋亡

李浩渤 陳 勇 陳 宇

(河北醫科大學第二醫院口腔內科，河北 石家莊 050000)

目前對于口腔癌的治療多采用放療配合手術等手段〔1～3〕，這些復合療法可以有效控制疾病發展，但副作用大，會對身體造成較大的負擔。老年人各項身體功能相對較弱，在老年階段發生口腔癌病變，復合療法的使用受到明顯的限制。傳統中醫藥在使用過程中藥效平和，毒副作用明顯較低，在老年病、慢性病的治療上具有極大的優勢。中國藥典記錄，姜科植物莪術具有破血行氣、消積止痛的作用〔4〕，臨床上可以作為抗腫瘤藥物，特別是抗早期宮頸癌的藥物進行使用。現代藥理研究證實莪術水提物及其多種有效成分對多種腫瘤有良好的抑制作用，可以直接抑制腫瘤細胞蛋白的合成〔5,6〕。本文旨在探究莪術水提物體內外對口腔癌細胞增殖的抑制作用，研究其對腫瘤細胞周期及notch1基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1細胞與動物 Tca8113口腔癌細胞，受贈于上海交通大學第二附屬醫院腫瘤科。KB口腔癌細胞購于美國模式培養物集存庫(ATCC)。

NCR/Nu裸鼠，雌雄各半，SPF級，體質量18～22 g，共50只，購自河北省實驗動物中心〔合格證號：SCXK(冀)20012-1-003〕。

1.2實驗試劑、儀器與藥物 RPMI1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS，Gibco)，凋亡試劑盒(四正柏)，Trizol(Life Technology)，逆轉錄及熒光定量PCR試劑盒(Thermo)，培養瓶、培養皿等細胞實驗耗材(Corning)。普通化學試劑均為國產分析純(天津大茂)。 超凈工作臺(蘇州蘇凈)，旋轉蒸發儀(上海亞恒)；酶標儀(Thermo Scientific)，熒光定量PCR儀(ABI)，冷凍高速離心機(Thermo)，流式細胞儀(貝克曼)，分析天平(梅特勒)。莪術購于北京同仁堂，使用5倍體積蒸餾水煎煮，沸后1 h停止，使用旋轉蒸發儀濃縮至生藥量為5 g/ml。

1.3細胞培養 復蘇口腔癌Tca8113和KB細胞株，從液氮中取出細胞后，置于37℃水浴鍋中搖動迅速解凍，1 000 r/min，3 min離心后，使用新鮮的RPMI1640含有10%FBS重懸細胞，并接種于細胞培養瓶。待細胞生長置大部分鋪滿培養瓶，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，待細胞變圓后，加入培養液終止消化，離心去除培養液加入新鮮培養液重懸，并傳代于新的培養瓶中。凍存如傳代，在離心去除培養液后使用含有10%FBS和10%二甲基亞砜(DMSO)的RPMI1640培養液重懸，加入凍存管并置于梯度凍存盒內，1 d后存于液氮。

1.4MTT法檢測口腔癌細胞的增殖 取傳1代的口腔癌細胞Tca8113和KB，調整細胞濃度為1×104，接種于96孔板中，每孔100 μl。12 h后，棄去細胞上清液，并加入配置好的含有0,1.25，2.50和5.00 μg/ml的莪術水提物的培養液。加入藥物培養20 h后，加入10 μl MTT，4 h后使用酶標儀在570 nm處讀取吸光度，計算抑制率。抑制率=(1-實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%。

1.5流式細胞術檢測口腔癌細胞的凋亡 取傳1代的口腔癌細胞Tca8113，調整細胞濃度為5×106個/ml，接種于6孔板中，每孔1 000 μl。12 h后，棄去細胞上清液，并加入配置好的含有0,1.25，2.50和5.00 μg/ml的莪術水提物的培養液。孵育24 h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗離心，并加入70%的酒精固定細胞，按照凋亡試劑盒說明書分別加入PI及Annexin V-FITC染色細胞后，4℃保存直至上機檢測。

1.6Q-PCR法檢測口腔癌細胞notch1基因的表達 取傳1代的口腔癌細胞Tca8113，調整細胞濃度為5×106個/ml，接種于6孔板中，每孔1 000 μl。12 h后，棄去細胞上清液，并加入配置好的含有0,1.25，2.50和5.00 μg/ml的莪術水提物的培養液。孵育24 h后，每孔加入1 ml Trizol，按照試劑盒說明書中的方法提取RNA，按照逆轉錄試劑盒方法逆轉錄成cDNA。按照Thermo Q-PCR試劑盒說明書進行notch1基因表達檢測。notch1引物：5′-ATCACTGCCCAGGAAACAAC-3′和5′-GTCCAGCCATTGACACACAC-3′。擴增條件為95℃，15 min；94℃，15 s；60℃，25 s；72℃，30 s；40個循環。數據使用2-△△Ct法分析。

1.7NCR/Nu小鼠腫瘤模型制備與給藥 取傳1代生長至對數期的細胞，使用PBS重懸細胞，調整濃度置1×107個/ml。除對照組裸鼠外，使用酒精棉消毒裸鼠右前肢皮膚，按照0.2 ml/只接種裸鼠。每天觀察腫瘤發生情況，排除未生長腫瘤小鼠9只，剩余小鼠隨機分為模型組(7只)，莪術水提物低、中和高劑量組各8只。待腫瘤生長至3～6 mm時，莪術水提物低、中和高劑量組分別灌胃25，50和100 mg/kg藥物，對照和模型組灌胃等量蒸餾水，共給藥5 w。

1.8腫瘤體積和質量測定 于末次給藥1 h后處死小鼠，分離腫瘤組織。使用千分之一游標卡尺檢測分離皮下移植瘤的長直徑(a)和短直徑(b)，計算腫瘤體積和抑制率。腫瘤體積=ab2/2，體積抑制率=(1-實驗組腫瘤體積/對照組腫瘤體積)×100%。測量完成后，使用清潔濾紙擦干凈血跡，使用分析天平稱重，計算腫瘤抑制率。質量抑制率=(1-實驗組腫瘤質量/對照組腫瘤質量)×100%。

1.9Q-PCR法測定腫瘤組織notch1基因的表達 分離得到的腫瘤組織稱重完成后，剪取100 mg置Trizol試劑內，按照試劑盒說明方法提取RNA，按照逆轉錄試劑盒方法逆轉錄成cDNA。notch1引物：5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′和5′-CATGGGATATGACTGCTC-3′。擴增條件為95℃，15 min，94℃，15 s；60℃，25 s；72℃，30 s；40個循環。數據使用2-△△Ct法分析。

1.10統計學分析 使用SPSS21.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1莪術水提物對口腔癌細胞Tca8113和KB增殖的影響 與對照組比較，莪術水提物低、中、高劑量組Tca8113細胞的吸光度明顯下降(P<0.05或P<0.01)，其抑制率分別為26.21%，42.89%和54.02%。與對照組比較，莪術水提物高劑量組KB細胞的吸光度明顯下降(P<0.05)，其抑制率為19.18%。莪術水提物低、中劑量組KB細胞抑制率分別為10.10%、11.35%。見表1。

表1 莪術水提物對口腔癌細胞Tca8113和KB的抑制率吸光度A值，n=3)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2莪術水提物對口腔癌細胞Tca8113凋亡的影響 與對照組〔(2.51±0.02)%〕比較，莪術水提物高劑量組的口腔癌Tca8113細胞凋亡率明顯增加〔(8.78±1.01)%，P<0.05〕，莪術水提物低、中劑量組凋亡率分別為〔(2.13±0.24)%，(4.72±1.90)%〕，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3莪術水提物對口腔癌細胞notch1基因表達的影響 與模型組(1.010±0.038)比較，莪術水提物中、高劑量組的notch1基因表達明顯增加(1.337±0.101，1.477±0.108；P<0.05)。莪術水提物低劑量組notch1基因表達量為1.123±0.044，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4莪術水提物對口腔癌細胞Tca8113移植瘤小鼠在體腫瘤體積和質量的影響 與對照組比較，模型組的腫瘤體積和質量明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，莪術水提物中、高劑量組的腫瘤體積明顯下降(P<0.05)，對腫瘤體積的抑制率分別為25.42%和46.65%；與模型組比較，莪術水提物中、高劑量組的腫瘤質量明顯下降(P<0.05)，對腫瘤質量的抑制率分別為27.01%和42.98%。莪術水提物低劑量組對腫瘤體積的抑制率為7.07%，對腫瘤質量的抑制率為7.01%。見表2。

表2 各組小鼠在體腫瘤的體積和質量

2.5莪術水提物對口腔癌細胞Tca8113移植瘤小鼠notch1基因表達的作用 與對照組(1.010±0.038)相比，模型組notch1基因表達明顯下降(0.643±0.017，P<0.01)。與模型組比較，莪術水提物中、高劑量組的notch1基因表達明顯增加(0.698±0.091，0.747±0.075；P<0.05)。莪術水提物低劑量組nothch1基因表達量為0.662±0.013，與對照組及模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

中醫認為腫瘤的發生和氣滯血瘀證有關，活血化瘀類藥物對于治療癌癥有著重要的作用〔7〕。莪術被證實是一種具有抗腫瘤作用的中藥〔8,9〕，本研究對莪術抗口腔鱗狀細胞瘤的作用進行了研究。

notch1基因在腫瘤的發生中表現出多種不同的作用，在不同的細胞類型和環境中，notch1基因可能出現促癌和抑癌的不同效果。有研究表明，notch1基因在皮膚癌、小細胞肺癌等癌癥中可以作為抑癌基因存在，notch1基因上調可以起到誘導癌細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用〔10,11〕。而在口腔癌組織樣本中，notch1基因的表達顯著性降低，因此增強notch1基因的表達、促進口腔癌細胞凋亡是口腔癌治療的途徑之一。本研究首先探討了莪術水提物體外抑制口腔癌細胞株Tca8113和KB的作用，發現其對不同的細胞株作用效果不同，對Tca8113效果更強，提示莪術在臨床應用時需要對癥試藥。因此，在之后進行莪術水提物對細胞凋亡及notch1基因表達影響的實驗時，選擇了Tca8113細胞進行深入研究。實驗證實，莪術水提物可以誘導該種口腔癌細胞凋亡，并且能夠起到在體抑制Tca8113細胞移植瘤生長的作用。同時，體外體內實驗同時證實，莪術水提物可以上調notch1基因的表達，這是莪術水提物抑制口腔癌細胞增殖的作用機制之一。本研究結果證實，莪術水提物具有體內外抑制口腔鱗狀細胞瘤的作用，而該作用與notch1基因表達的抑制有關。