右歸丸能啟動小鼠胚胎干細胞1B10和D3的生殖分化

向俊蓓 劉綿學 謝林峰 萬 謙

(四川護理職業學院，四川 成都 610000)

補腎中藥復方右歸丸是由金匱腎氣丸減去“三瀉”(澤瀉、 茯苓、丹皮)，加鹿角膠、菟絲子、杜仲、枸杞子、當歸而成，具有溫補腎陽作用。現代研究發現右歸丸能增強機體免疫功能、保護實驗性腎陽虛動物的重要臟器、調節性激素含量、抗衰老、調節環核苷酸含量、調節血漿腎素活性和醛固酮含量〔1〕。補腎中藥單體齊墩果酸能夠在體外誘導多種胚胎干細胞向生殖細胞方向的分化〔2，3〕，右歸丸中的山茱萸含有一定量的齊墩果酸，且右歸丸同為補腎中藥，提示其可能也有此誘導作用。本文擬分析右歸丸對干細胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及細胞株 20只清潔級SD大鼠，體重180～220 g，雌雄各10只，合格證號：SCXK(川)2008-19，使用許可證號：SYXK(川)2008-100。小鼠胚胎干細胞1B10來源于四川大學華西校區，小鼠胚胎干細胞D3購自中國科學院上海細胞庫。

1.2藥品和試劑 右歸丸(批號1013451)購自北京同仁堂，藥準字號為Z23020593(北京)，DMEM高糖培養液(批號20130401)、胎牛血清(FBS)(批號20130405)、細胞培養用雙抗(青霉素和鏈霉素)(批號20130315)、磷酸緩沖液(PBS)(批號20130505)、細胞消化用胰蛋白酶(批號20130408)均購自成都哈里公司；非必需氨基酸(NEAA)(批號：03985 K11)、β-巰基乙醇(β-ME)(批號：862986)由美國Gibco公司生產；白血病抑制因子(LIF)(批號：1993949)由美國Millipore公司生產；普通細胞6孔培養板(批號：04718601)和超低吸附培養6孔板(批號：10312041)由美國Corning公司生產；RNA提取試劑盒Tri Reagent(批號：4071)由美國Molecular Research Center公司生產；cDNA合成試劑盒(批號：00128824)由Fermentas公司生產；Sybr Green Qpcr試劑盒(批號：14128600)由Roche公司生產。

1.3儀器 中國優普公司制造的純水機(UPR-I-10T)；美國Thermo Scientific公司制造的CO2細胞培養箱(3111)；中國蘇州凈化公司制造的超凈工作臺(SW-CJ-2FD)；中國Anke公司制造的50 ml離心機(TDL-40B)；美國Thermo公司制造的高速臺式冷凍離心機(Legend Micro 17R)；Leica公司制造的倒置顯微鏡(DMI3000B)；Bio-Rad公司制造的定量PCR儀(CFX96)。

1.4培養小鼠胚胎干細胞 使用小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3培養1B10和D3的飼養層細胞。用DMEM高糖培養液培養NIH3T3，DMEM高糖培養液成分：10% FBS、100 U/ml盤尼西林、0.1 mg/ml 鏈霉素。培養干細胞的DMEM高糖培養液成分：17% FBS、100 U/ml 盤尼西林、0.1 mg/ml 鏈霉素、0.1 mmol/L NEAA、0.1 mmol/L β-ME、1 000 U/ml LIF。培養孔中的NIH3T3生長到90%匯合度時，加入絲裂霉素C，至終濃度為10 μg/ml。放入細胞培養箱中孵育3 h，之后用無菌PBS清洗細胞5次，加入適量的干細胞培養液，接種干細胞至培養孔，每天更換培養液，4～7 d后培養完成。

1.5誘導擬胚體(EB)的形成 誘導EB形成的培養液：DMEM高糖培養液，17% FBS、100 U/ml 盤尼西林、0.1 mg/ml 鏈霉素、0.1 mmol/L NEAA、0.1 mmol/L β-ME。加入胰蛋白酶消化細胞；將培養板放入細胞培養箱中孵育3 min；吹打細胞呈單細胞狀態；溫浴細胞混合液，利用差速貼壁法分離飼養層細胞NIH3T3和干細胞；收集混合液靜置后的上清液(大部分懸浮細胞為干細胞)，移入超低吸附培養板；24 h后，可觀察到懸浮的類圓形誘導EB形成，收集所有EB待用。

1.6制備右歸丸大鼠含藥血清(YGW-RS)及空白血清(RBS) 取20只SD大鼠，適應性飼養1 w后，隨機分為空白組和含藥組每組10只。含藥組灌服液化后的右歸丸，劑量均為5.0 g/kg，給藥容量均為20 ml/kg，空白組灌服蒸餾水。給藥后30、60、90 min 分別眼底靜脈叢取血，靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離每組不同時間段的血清，混勻每組3個時間段的血清，過濾除菌備用。

1.7用右歸丸大鼠含藥血清干預干細胞形成的誘導EB 將收集到的EB移入普通細胞培養板。24 h內EB貼壁并生長；24 h后，對相應的培養孔中分別加入YGW-RS和RBS，血清終濃度為4.5%(V/V)，不加入任何血清的培養孔做空白對照(BCC)。干預72 h后，對比細胞形態的變化。

1.8實時熒光定量PCR(qPCR)分析 貼壁的EB被干預72 h后，提取各孔的總RNA，合成cDNA，以cDNA為模板進行qPCR分析，目標基因為11種與生殖分化相關的基因，Oct-4正向：CGGAAGAGAAAG CGAACTAGCA，反向：TGATTGGCGATGTGAGTGA TC；GDF-9正向：TGCTTTGCCTGGCTGTGTT，反向：TCTACAGGCAGCAGCAAGGA；Stra8正向：TGCCACCTGCAA CTCAGAAA，反向：CTGGTTCCTGGTTTAATGGAGTGT；SCP3正向：ATCTGGGAAGCCACCTTTGG，反向：CTGGAGCCTTTTCATCAGCAA；Mvh正向：CAAAGGAACA ACGCCAAACC，反向：TTGCCCAACAGCGACAAAC；ZP1正向：TCGAGCCTGGCTTTGAATACA，反向：CAA ACCGGTTCCCAAATTCAT；ZP2正向：CTCTCTTCACTCAAGCTGACCTTCT，反向：AAACCCATCCTGTGCACACA；ZP3正向：CCGGGTGTCCGTGGATAC，反向：CGA GGGTCGTGGAGTAGGAA；Itga6正向：GACATGAAGT CCGCGCATCT，反向：TGCCACCCATCTGCATT；Itgb1正向：TCCAAATAAGGAGTCTGAAACCATT，反向：GGA TGCCATGGCTTTGACA；TP2正向：CATCCGTGCACTCT CGACACT，反向：CCTCCTGACGGCCTTTCTCT；以GA PDH作為內參基因，GAPDH正向：GGCAAATTCA ACGGCACAGT，反向：GCCTCACCCCATTTGATGTT。

1.9統計學分析 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1干細胞的生長和EB形成 1B10和D3分別在飼養層細胞NIH3T3上形成了類似“鳥巢”狀的克隆，說明兩種干細胞生長正常；兩種干細胞都形成了類圓形的EB，說明EB形成正常，見圖1。

2.2右歸丸對貼壁生長EB的干預 干預后，1B10的EB貼壁生長后除了被RBS細胞干預的更細碎外，其余被干預的細胞形態相近。D3的EB貼壁生長后被各藥物干預后的細胞形態相近，見圖2。

圖2 干預后1B10、D3的EB貼壁生長后細胞形態(標尺=100 μm)

2.3YGW-RS對1B10和D3生殖分化的影響 對于1B10，RA顯著上調Stra8、Mvh、ZP1、ZP2表達，顯著下調SCP3、ZP3、Oct-4表達(P<0.05)；對于D3，RA顯著上調Stra8表達，顯著下調Oct-4、GDF-9、SCP3、Mvh、ZP3、Itga6表達(P<0.05)；對于1B10，YGW-RS顯著上調Oct-4、SCP3、Mvh、ZP1、ZP2、ZP3、Itga6表達，顯著下調Stra8表達(P<0.05)；對于D3，YGW-RS顯著上調Oct-4、GDF-9、Stra8、ZP2、TP2表達(P<0.05)，見表1，表2。

表1 RA對1B10、D3生殖分化標志基因轉錄表達的影響

表2 YGW-RS對1B10、D3生殖分化標志基因轉錄表達的影響

3 討 論

胚胎干細胞已有被成功誘導分化為生殖細胞的報道，甚至利用分化出的生殖細胞完成了受精、形成胚胎等過程〔4，5〕，而且，胚胎干細胞的多能性高于成體干細胞，理論上對右歸丸可能的促分化作用更敏感。

Oct-4對于保持干細胞的多能性很重要，過低或者過高的Oct-4將導致干細胞分化〔6，7〕。GDF-9 是向雌性生殖細胞分化的早期標記基因〔8〕。Stra8是向雄性和雌性生殖細胞分化的共同的早期標記基因〔9〕。SCP3 是減數分裂的早期標記基因〔10〕。Mvh是向雌性生殖細胞和雄性生殖細胞分化的早期標記基因〔11〕。ZP1、ZP2和ZP3是卵子細胞形成的標記基因〔12〕。Itga6、Itgb1和TP2 是精子細胞形成的標記基因〔4，5〕。

本研究說明右歸丸啟動了1B10的雌性生殖分化，同時啟動了D3的雄性和雌性生殖分化；RA啟動了1B10的雄性生殖分化，RA不能啟動D3的生殖分化。補腎中藥復方右歸丸能啟動所考察的兩種干細胞的生殖分化，而且表現出的誘導作用的普遍性高于公認的生殖分化誘導物RA，右歸丸可能具有啟動干細胞生殖分化的能力。