腹膜透析液對大鼠腹膜間皮細胞血管內皮生長因子及其受體表達的影響

王雅寧 藺 超 劉云啟 高金祥 劉益濤 高 潔

(濱州醫學院附屬醫院腎內科,山東 濱州 256603)

在長期腹膜透析過程中，腹膜結構和功能的改變與腹膜血管生成密切相關，越來越多證據表明，腹腔局部血管內皮生長因子(VEGF)的上調是其中心環節〔1，2〕。成人VEGF主要通過與其受體VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(Flk-1/KDR)結合發揮生物學效應。此外，Flt-1基因尚編碼一種可溶性的形式sFlt-1，其與VEGF有很強的親和性，與之結合后即阻斷VEGF的一系列分子生物學效應〔3〕。與長期腹膜透析腹膜損害有關的諸多因素，如透析液的生物不相容性、葡萄糖降解產物(GDP)、腹腔慢性炎癥等均可影響腹腔局部VEGF表達〔4〕。本文旨在探討不同腹膜透析液對大鼠腹膜間皮細胞(RPMCs)VEGF及其受體表達及分泌的影響。

1 材料和方法

1.1材料 清潔級SD雄性大鼠，體重150～180 g，由山東大學實驗動物中心提供。主要試劑：DMEM/F12培養基、DMEM培養基、胎牛血清(FBS，美國Gibco)，Trizol試劑(Ambion公司)，腹膜透析液(美國Baxter公司)，RT試劑盒(Fermentas公司)，雞抗大鼠VEGFR2抗體(Prosci公司)，兔抗大鼠VEGFR1抗體(Labvison公司)，小鼠抗大鼠GAPDH抗體、小鼠二抗、兔二抗(美國CST公司)，雞二抗(Upstate公司)，鼠VEGF及sFlt-1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(R&D公司)。

1.2RPMCs的分離培養及鑒定 取SD雄性大鼠，腹腔內注射含0.25%胰酶及0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液進行消化。120 min后無菌操作下剖開大鼠腹腔，吸取腹腔內液體，置15 ml離心管，1 500 r/min離心10 min，棄上清。DMEM/F12(含0.5%FBS)洗滌1次，離心棄上清。加入含12%FBS的DMEM/F12培養基，將細胞打散為均勻懸浮液，接種于25 cm2培養瓶中，置于37℃ 5% CO2培養箱中培養。待90%～95%細胞融合，消化傳代。第2代細胞經形態鑒定及抗細胞角蛋白抗體、抗Ⅷ因子抗體免疫組織化學鑒定，確定為腹膜間皮細胞后，用于下游試驗。

1.3不同腹膜透析液對RPMCs VEGF及其受體表達的影響 穩定培養的第1代RPMCs消化傳代，同步化培養24 h后，分別以不同腹膜透析液〔1.50%葡萄糖腹膜透析液(dextrose)(低糖組)、2.50% dextrose(中糖組)、4.25% dextrose(高糖組)、7.50% icodextrin(糊精組)〕進行刺激培養，無血清DMEM為陰性對照(對照組)，刺激24 h后收集細胞，提取核酸及蛋白以供檢測。

1.4RT-PCR檢測RPMCs的VEGF、VEGFR1、VEGFR2和sFlt-1 mRNA表達 沖洗RPMCs后，按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，隨后取2 μg RNA，按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。基因序列通過GenBank獲得，引物設計由PRIMER5.0軟件按照引物要求完成，由上海英駿公司合成。VEGF：上游 5′-CCACGACAGAAGGGGAGCA-3′，下游5′-ACACCGCATTAGG GGCACA-3′；VEGFR1：上游5′-CAAGGGACTCTACAC TTGTC-3′，下游5′-CCGAATAGCGAGCAGATTTC-3′；VEGFR2：上游5′-GCCAATGAAGGGGAACTGAAGAC-3′，下游5′-TCTGACTGCTGGTGATGCTGTCA-3′；sFlt-1：上游5′-AATCTGCTCGCTATTCGGTG-3；下游5′-GTGGGTAGAGAGGTGGGCTT-3′；GAPDH：上游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反應結束后取10 μl PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠(EB)染色，凝膠成像系統成像及進行掃描定量分析，以其所測得積分吸光度與內參照GAPDH積分吸光度的比值代表半定量值。

1.5Western印跡檢測RPMCs的VEGFR1、VEGFR2蛋白表達 裂解細胞后，置于冰上，4℃ 10 000 r/min離心10 min，收集上清，測蛋白濃度。取20 μl總蛋白上樣于7%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離，濕法轉膜，5%脫脂奶粉室溫1 h。分別加入兔抗大鼠VEGFR1抗體，雞抗大鼠VEGFR2抗體，小鼠抗大鼠GAPDH抗體，4℃孵育過夜。以辣根過氧化物酶(HRP)標記的相應二抗孵育1 h，洗膜；電化學發光(ECL)顯影，自動成像系統成像并分析。

1.6ELISA檢測RPMCs培養上清中VEGF及sFlt-1蛋白表達 收集細胞培養上清，離心去除細胞碎片。15 min內加完所有樣本，具體步驟按照說明書進行。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1大鼠腹膜間皮細胞的培養和鑒定 常規培養的大鼠腹膜間皮細胞生長至融合狀態后呈現多邊形、菱形、橢圓形，大小不等，具有典型的鵝卵石狀或鋪路石樣上皮細胞形態，抗大鼠角蛋白(Keratin)、波形蛋白(Vimentin)陽性，證實為腹膜間皮細胞見圖1。

圖1 大鼠腹膜間皮細胞的鑒定

2.2各組RPMCs VEGF及其受體mRNA表達 中糖組、高糖組VEGF、VEGFR1、sFlt-1 mRNA表達水平顯著高于低糖組、糊精組及對照組(均P<0.01)，低糖組與糊精組明顯高于對照組(均P<0.05)，低糖組與糊精組差異無統計學意義(P>0.05)。中糖組、高糖組VEGFR2 mRNA表達顯著低于低糖組、糊精組及對照組(均P<0.01)，低糖組與糊精組VEGFR2 mRNA表達低于對照組(P<0.05)，低糖組與糊精組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1，圖2。

圖2 各組RPMCs的VEGF、VEGFR1、sFlt-1和VEGFR2 mRNA表達

組別VEGF mRNAVEGFR1 mRNAsFlt-1 mRNAVEGFR2 mRNA對照組0.236±0.0191)0.118±0.0111)0.131±0.0121)1.234±0.1091)低糖組0.578±0.0231)2)0.203±0.0181)2)0.364±0.0321)2)0.882±0.0651)2)中糖組0.976±0.1100.685±0.0490.782±0.0510.276±0.019高糖組1.146±0.2140.981±0.0780.912±0.1160.193±0.012糊精組0.553±0.0421)2)0.211±0.0211)2)0.385±0.0141)2)0.891±0.0861)2)

與中糖及高糖組比較：1)P<0.01;與對照組比較：2)P<0.05

2.3各組RPMCs VEGF及其受體蛋白表達比較 Western印跡法結果顯示，中糖組、高糖組VEGFR1蛋白表達水平顯著高于低糖組、糊精組及對照組(均P<0.05)，低糖組與糊精組差異無統計學意義(P>0.05)；中糖組、高糖組VEGFR2蛋白表達顯著低于低糖組、糊精組及對照組(均P<0.01)，低糖組明顯低于對照組(P<0.01)；ELISA結果顯示，中糖組、高糖組VEGF、sFlt-1表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，高糖組顯著高于低糖組及糊精組(P<0.05)，低糖組與糊精組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3，表2。

圖3 各組RPMCs的VEGFR1和VEGFR2蛋白表達

組別VEGF(pg/ml)sFlt-1(pg/ml)VEGFR1VEGFR2對照組236.7±25.4113.1±27.30.142±0.0120.703±0.081低糖組325.3±30.2123.2±21.60.245±0.0270.452±0.0273)中糖組437.2±33.74)152.8±25.44)0.487±0.0321)4)0.211±0.0182)3)高糖組528.1±36.51)4)198.7±36.11)4)0.602±0.0461)4)0.122±0.0102)3)糊精組318.0±28.9121.9±19.90.250±0.0150.649±0.059

與低糖組及糊精組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與對照組比較：3)P<0.01,4)P<0.05

3 討 論

在腹膜透析過程中，腹腔長時間暴露于傳統的含糖腹膜透析液可引起腹膜功能改變、腹膜間皮細胞丟失、血管增生及腹膜纖維化，血管增生可導致腹膜有效表面積增大，溶質轉運系數增加，最終導致超濾衰竭〔5〕。研究表明，腹腔局部VEGF的上調是其中心環節〔6，7〕。動物模型表明，高乳酸鹽濃度、轉化生長因子(TGF)-β1、低pH等均可促使腹膜血管生成、VEGF合成增加。Bajo等〔8〕證實，用傳統的腹透液刺激腹膜間皮細胞后，E-鈣黏蛋白(cadherin)表達減少，細胞形態發生改變，VEGF表達增加，而接受低GDP腹透液刺激的細胞則無上述變化。VEGF家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子(PLGF)，其中VEGF-A(通稱VEGF)是目前發現最為重要的血管生成正性調節因子，主要通過結合VEGFR1(Flt-1)和VEGFR2(Flk-1/KDR)發揮分子生物學效應〔9，10〕，此外，Flt-1基因僅由選擇性剪切的6個Ig區域組成，與VEGF有很強的親和性。VEGF與受體結合后可迅速增加細胞內Ca2+水平，通過磷酸肌醇特異性磷脂酶C途徑，使細胞內IP3水平升高，促進新生血管生成、增加血管通透性。Io等〔11〕研究發現，腹膜組織中VEGF及VEGFR-1 mRNA表達增加，在第21和35 d達到高峰，與本文結果趨勢一致。Zhang等〔12〕在尿毒癥患者腹膜血管壁檢測出了VEGFR1和VEGFR2，且VEGFR2與腹膜微血管密度、小分子溶質轉運速率及24 h腹膜蛋白排泄密切相關，提示VEGFR2可能是腹膜基線轉運特征的重要決定因子。與本研究結果不同，可能與體內檢測的是腹膜組織總VEGFR2表達，而本研究僅檢測腹膜間皮細胞VEGFR2表達有關。此外，由于sFlt-1缺乏酪氨酸激酶結構域，沒有信號轉導功能，當sFlt-1出現后與VEGFR1競爭PLGF、VEGF，與VEGFR2競爭VEGF，也是細胞接受刺激后VEGFR2下調的原因〔13〕。最近研究顯示，VEGF的高水平可預測患者的全因死亡率，升高的sFlt-1與炎癥因子可聯合增加患者全因死亡率的風險；此外，sFlt-1同內皮細胞損傷的標志物細胞間黏附分子(ICAM)-1、血管細胞黏附分子(VCAM)-1正相關，VEGF和sFlt-1同C反應蛋白及白細胞計數相關〔14，15〕，提示VEGF及sFlt-1通過促使炎癥細胞趨化參與炎癥過程〔16〕，其潛在的病理生理學作用可能為在細胞激活過程中，使其更容易受到炎癥因子的攻擊，甚至同炎癥因子有協同作用〔17〕。糊精腹膜透析液含7.5%多聚葡萄糖，由谷物淀粉水解后產生，其85%分子量在16 800～45 000 D，只有6%分子量小于16 800 D。由于其分子量較大，不能通過腹膜上的小孔吸收，只能通過液體的對流緩慢吸收，故能長時間維持有效滲透壓濃度，在高轉運及高平均轉運患者能改善超濾〔4，18〕，且由于其滲透濃度低，較少形成糖基化終產物，故較dextrose生物相容性更好〔19〕，此外，有研究證實，糊精腹膜透析液能更好地保護殘余腎功能〔20〕。有文獻報道，7.5% icodextrin也會使腹膜間皮細胞增殖和活力下降，細胞內活性氧增加，細胞功能下降，但和1.5% dextrose調節水平一致，且低于4.25% dextrose〔19〕，與本文結果趨勢基本一致。筆者推測，7.5% icodextrin對于VEGF系統的調節是其生物相容性較好的機制之一。綜上，腹膜透析液能顯著上調VEGF及其受體VEGFR1、sFlt-1的表達，下調VEGFR2的表達，以2.5% dextrose及4.25% dextrose 最為顯著，7.5% icodextrin對VEGF及其受體的調節水平低于2.5% dextrose及4.25% dextrose，從新的角度證實了icodextrin具有良好的生物相容性，但VEGF的受體在透析液刺激下發生上述變化的意義還待動物模型證實。