RNA干擾基質金屬蛋白酶-9對骨肉瘤MG-63細胞侵襲、遷移的影響

劉 丹 陳國福 劉永慶 裴寶瑞 劉 斌

(唐山市豐潤區人民醫院骨科，河北 唐山 063000)

骨肉瘤惡性程度高，骨肉瘤的轉移率及病死率高，確診患者有50%以上不同程度的肺部轉移。雖然目前對骨肉瘤的治療已經取得了很大的進步，但對腫瘤轉移及復發等問題仍然沒有有效解決，骨肉瘤患者伴有肺部轉移生存率沒有明顯提高〔1〕。在基因治療中尋求有效的治療靶點成為急需解決的關鍵問題之一。基質金屬蛋白酶(MMP)-9是鋅離子依賴性蛋白水解酶家族成員之一，主要具有降解細胞外基質(ECM)和基底膜的能力，降解基底膜的蛋白——Ⅳ型膠原〔2〕，并能促進血管生成和調節細胞黏附性，促進細胞的遷移運動〔3〕，其在腫瘤的侵襲和轉移中起到重要作用。研究表明MMP-9在骨肉瘤中存在過度表達的現象〔4〕。本研究選取MMP-9作為靶基因來研究其對骨肉瘤MG-63細胞侵襲、遷移的作用。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 人成骨肉瘤MG-63細胞株由華北理工大學基礎醫學實驗室饋贈；10%胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養基購置于美國Gibco公司；慢病毒載體購于上海吉凱基因化學技術有限公司，shRNA-MMP-9陽性序列：5′-UCCAGGGCGAGGACCAUAGAG-3′。shRNA-MMP-9陰性對照序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAGTCT-3′；RT-PCR實驗試劑盒購于美國Invitrogen公司；Matrigel 購置于BD公司。Transwell小室購置于BI公司；MMP-9和血管內皮生長因子(VEGF)一抗體和二抗體均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2細胞培養 骨肉瘤MG-63細胞用含10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI1640完全培養基，并置于37℃、5%CO2飽和濕度下培養，當細胞生長匯合至80%時可進行消化傳代。

1.3細胞轉染 取處于對數生長期細胞，常規消化調整細胞密度為5×106/ml接種于6孔板中，實驗分為：轉染組(轉染shRNA-MMP-9序列)、對照組(轉染shRNA-MMP-9-NC序列)、空白組〔磷酸鹽緩沖液(PBS)〕。轉染操作參照吉凱慢病毒轉染說明書，轉染48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察轉染率。

1.4RT-PCR檢測mRNA表達 轉染48 h后收集各組細胞，參照Trizol說明書一步法提取細胞總RNA，檢測RNA濃度復合實驗要求后，用M-MLV試劑盒將RNA樣品逆轉錄反應合成cDNA后，再使用SYBR試劑盒進行PCR擴增反應，引物序列MMP-9為上游：5′-CTGTTGGACTGCTGCTTTGCTG-3′；下游：5′-GTCTCCTGAAAGGTTTGGAAT-3′。β-actin為上游5′-GTTGGGACCTGAGAGACTA-3′；下游：5′-TGGCGATGTCCAGTCACACT-3′。擴增條件：93℃預變性10 min，93℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環后再72℃延伸10 min。采用相對定量的方法對實驗結果進行分析。

1.5Western印跡檢測蛋白表達 轉染48 h后收集對數生長期各組細胞，提取細胞總蛋白，檢測蛋白濃度，每組樣品取50 μg蛋白質/泳道，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，進行電轉，設置250 mA 90 min將凝膠中蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；分別滴加150 μl一抗miR-143(1∶1 000)和MMP-13(1∶2 000)及一抗β-actin(1∶1 000)，4℃過夜；三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBST)洗滌10 min×3次；加入100 μl二抗(1∶1 000)，37℃孵育1.5 h；TBST洗膜10 min×3次。進行顯色，掃描條帶，Image J軟件分析光密度值。

1.6Tanswell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 將4℃過夜Matrigel和4℃預冷改良Eagle培養液(DMEM)按照1∶8比例進行混勻后，鋪加在小室上室面，37℃孵育30 min，使Matrigel聚合成凝膠狀態，制備Transwell小室。各組細胞進行常規消化，稀釋細胞濃度至5×105/ml，滴加150 μl/孔至小室的上室，下室中加入含20% FBS的完全培養液600 μl，繼續培養24 h。吸掉上層小室的培養液并用棉簽輕柔擦拭Matrigel膠及沒有穿透的細胞，將聚碳酸酯膜小心的切取下來，常規進行蘇木素染色，中性樹膠封片。在200倍的光學顯微鏡下，隨機選取出5個視野拍照并計數在每個視野中穿出膜的細胞數目，取其平均值及標準差，以此作為評估各組細胞侵襲能力的指標。

1.7細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 采用Marker筆在6孔板背面畫出均勻間隔0.8 cm左右的橫線，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。各組細胞常規消化制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×106/ml。細胞融合率達到100%時用10 μl的槍頭作劃痕，劃痕完畢后，PBS輕洗細胞3次，漂洗去除劃下的細胞，繼續培養。按0，24，48 h時間點取樣，拍照，用Image J軟件分析培養0、48 h時的各組劃痕情況。

1.8統計學方法 采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析，組間比較使用SNK法。

2 結 果

2.1細胞轉染率 利用激光共聚焦顯微鏡檢測轉染效率，根據最強紅色熒光判斷轉染率，轉染率可達90%以上，證實慢病毒介導的轉染方法轉染率高。見圖1。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察轉染率(×400)

2.2MMP-9和VEGF的mRNA表達 轉染組MMP-9 和VEGF的mRNA表達水平相比于對照組和空白組顯著降低(P<0.05)，而對照組和空白組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組MMP-9和VEGF mRNA表達

與對照組和空白組比較：1)P<0.05，下表同

2.3MMP-9和VEGF蛋白的表達 轉染組MMP-9、VEGF蛋白的表達水平明顯低于對照組及空白組(P<0.05)；空白組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測MMP-9和VEGF蛋白的表達

組別MMP-9VEGF轉染組0.175±0.2261)0.152±0.1051)對照組0.328±0.0150.338±0.312空白組0.343±0.6030.356±2.205F/P值6.52/0.005.86/0.00

2.4細胞的侵襲能力 各組的侵襲細胞數分別為：轉染組(56.37±3.29)個/視野、對照組(92.06±3.56)個/視野，空白組(93.05±1.52)個/視野；與空白組和對照組相比，實驗組侵襲細胞數明顯減少(P<0.05)，空白組和對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力(蘇木精染色，×200)

2.5細胞的遷移運動能力 轉染組、對照組和空白組劃痕愈合率分別為23.63%±1.47%、57.17%±3.86%、58.13%±2.35%；空白組和對照組差異無統計學意義(P>0.05)，轉染組明顯小于對照組及空白組(P<0.05)。

3 討 論

骨肉瘤惡性程度高，好發于兒童及青少年，發生轉移早，預后差，腫瘤新生微血管的形成和細胞外基質(ECM)的降解是骨肉瘤生長、侵襲、轉移及復發等過程中的關鍵環節。基底膜和ECM是抵御和抑制腫瘤侵襲和轉移的天然屏障。惡性腫瘤在局部侵襲和轉移的過程中，癌細胞必須具備降解ECM和基底膜的生物學能力。MMPs是鋅離子依賴蛋白水解酶，能降解ECM成分，與腫瘤浸潤、轉移、血管形成關系十分密切〔5〕。MMPs在腫瘤中呈高表達，在促進腫瘤的侵襲、轉移中有重要作用。一方面通過激活和釋放血管內皮生長因子而促進腫瘤血管的生成，另一方面通過降解ECM而降低微血管生成的壓力〔6〕。MMP-9是MMPs家族成員之一，屬于Ⅳ型膠原酶，MMP-9是消化降解Ⅳ型膠原最關鍵的酶，主要參與基質的降解和再塑，并且與間質血管關系密切，調控腫瘤的浸潤和轉移能力〔7〕。MMP-9通過直接或間接降解基底膜和ECM成分調節腫瘤細胞與基質的黏附，激活具有活性的酶等作用來促進腫瘤細胞的局部侵襲和遠處轉移〔8〕。MMP-9在多種惡性腫瘤呈高表達，且其表達水平與該腫瘤的血管生成、侵襲、轉移及復發等密切相關〔9〕。研究表明，MMP-9在骨肉瘤組織中表達顯著增高，而且其與骨肉瘤的惡性程度、局部浸潤、遠處轉移及腫瘤復發有關〔4〕，是臨床評價該病患者治療效果的重要指標〔10〕。

骨肉瘤的侵襲、轉移及腫瘤血管形成是一個多階段、多基因參與的復雜過程。血管生成相關因子在骨肉瘤組織直徑超過2 mm，新生微血管的形成過程中起著決定性作用。VEGF是目前作用最強、研究最清楚的一種多功能促進腫瘤的血管生長因子，通過與血管內皮細胞受體特異性結合，促進內皮細胞變異、運動、遷徙、增加血管通透性及血漿蛋白滲出等促進腫瘤血管生成作用。由于新生微血管基底膜缺損，通透性大，癌細胞易侵入血管，發生局部侵襲和遠處轉移。另外VEGF還可以通過增加ECM促進腫瘤血管形成，也可直接作用于血管內皮細胞，起到促進細胞分裂、改變細胞形態及遷移血管構建的作用〔11〕。李瑞玲〔12〕采用免疫組化檢測發現骨肉瘤中MMP-9和VEGF的表達量明顯高于良性骨腫瘤組織，并且與骨肉瘤臨床分期和轉移相關，說明骨肉瘤中MMP-9和VEGF表達明顯上調，與骨肉瘤的發生發展及浸潤、轉移有關。

RNA干擾(RNAi)是最近幾年新興的基因沉默技術，是將shRNA或siRNA通過載體介導入細胞內，從而達到其發揮沉默基因的作用，由于shRNA比siRNA作用更高效、穩定，因此目前大部分被設計成shRNA。RNAi具有抑制率高，易篩選靶序列，效率高等特點，已應用于基因功能研究及腫瘤疾病的基因治療等。

本研究說明轉染成功。利用RNA干擾技術沉默MMP-9，通過作用于VEGF，可降低骨肉瘤MG-63細胞的侵襲和遷移能力。有研究設計合成針對MMP-9的siRNA利用脂質體轉染胃腺癌細胞SGC7901發現靶向MMP-9的siRNA不僅能特異性降低MMP-9 mRNA及蛋白的表達，且能抑制胃腺癌細胞的侵襲和遷移〔13〕。胡娜等〔14〕利用siRNA干擾黑色素瘤高轉移細胞B16F10的MMP-9和FAK雙基因，發現可抑制小鼠黑色素瘤生長和在體遷移。Mei等〔15〕應用siRNA技術沉默骨肉瘤細胞VEGF發現細胞增殖與浸潤明顯受到抑制，王家琪等〔16〕將攜帶siRNA-VEGF的骨肉瘤細胞導入裸鼠體內，發現腫瘤微血管密度、體積及重量受到抑制。

利用RNA干擾技術沉默基因可調控骨惡性腫瘤的生長、侵襲轉移、耐藥性等，shRNA在骨肉瘤的基因靶向治療中顯示出良好的應用前景。然而，關于shRNA誘導基因沉默在惡性骨腫瘤中的研究比較局限，許多研究仍然處于基礎探索研究階段，如何與臨床治療相結合則需要進一步研究。隨著對shRNA誘導基因沉默在骨肉瘤研究中的不斷深入，shRNA誘導基因沉默有望成為骨肉瘤臨床治療的有效手段。