紫草素上調RIP1和RIP3表達誘導量引發肺腺癌A549細胞程序性壞死的機制

張海鵬 高麗娜 隋 雨 張凱峰 劉超英

(吉林大學第一醫院呼吸科，吉林 長春 130000)

非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%，而肺腺癌占NSCLC的50%〔1～3〕。肺癌的診斷率逐年提高，但肺癌患者的5年生存率卻未見顯著提高〔3〕，原因之一是肺癌對傳統化療藥物的耐藥越來越嚴重〔4〕。故尋求新的通路來誘導肺癌細胞壞死迫在眉睫。而程序性壞死的出現〔5～7〕，為肺癌的治療開辟了新的窗口，程序性壞死以形成受體相互作用蛋白酶(RIP)1和RIP3組成的壞死體為核心來誘導細胞程序性壞死〔8，9〕。紫草素(shikonin)是提取于紫草根部的萘醌類化合物〔10〕。研究證實紫草素具有誘導腫瘤細胞程序性壞死作用〔8，11～14〕，但紫草素對人肺腺癌細胞A549的作用尚無文獻報道，本研究探討紫草素對人肺腺癌A549細胞的作用并闡明其機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 紫草素，RIP1的特異性抑制劑Nec-1(necrostatin-1)和抗氧化抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)(N-acetyl-L-cysteine)購自Sigma公司。 RIP3的特異性抑制劑GSK(GSK-872)購自Calbiochem公司。將紫草素溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，使其儲存濃度為50 mmol/L。抗RIP1抗體、抗RIP3抗體和抗(MLKL)抗體購自Abcam公司。 β-actin抗體購自Santa Cruz公司。 其他試劑購自Sigma公司，Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2細胞來源 人肺腺癌細胞(A549)來自中國科學院上海細胞生物學研究所(中國上海)。

1.3細胞系和細胞活力測定 將A549在補充有10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養基中培養，并在37℃和5%CO2潮濕環境中維持。 實驗中使用對數中期的細胞。將A549(7×104個細胞/孔)接種于96孔微量培養板上培養24 h，然后用10 μmol/L的紫草素處理24 h。 使用MTT法測定570 nm吸光度，細胞存活力=A549細胞吸光度/對照組細胞吸光度。

1.4通過Annexin V/碘化丙啶(PI)檢測細胞死亡方式 細胞死亡方式的探尋是以Annexin V/PI 雙染色法為基礎的〔15〕。收集不同濃度紫草素處理24 h的A549。 然后，用Annexin V-FITC試劑盒評估細胞死亡形式。 將收集的細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，重懸于400 ml 1×結合緩沖液(10 mmol/L HEPES/NaOH，140 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L CaCl2，pH7.4)。將細胞(100 μl)轉移至含有5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI的5 ml培養管中，然后在室溫下避光孵育15 min。每個管中加入1×結合緩沖液后，通過流式細胞術分析染色的細胞。 使用CELLquest軟件分析細胞死亡率。 通過每管收集20 000個細胞進行數據采集，并確定每個實驗條件下活細胞和死細胞的數量。

1.5Western印跡檢測蛋白表達 用刮刀收集后通過離心收集A549在4℃以1 000 r/min離心10 min以獲得上清液。 使用Bio-Rad蛋白質試劑盒測定蛋白質含量。將等量的蛋白質在10%聚丙烯酰胺(SDS)凝膠上電泳并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，Billerica，MA，USA)。 在室溫下用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)中的3%牛血清白蛋白封閉膜30 min，然后在4℃用抗RIP1(1∶1 000)、抗RIP3(1∶1 000)、抗MLKL(1∶1 000)抗體、抗β-actin(1∶1 500)抗體孵育。與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG(1∶2 000)孵育后，洗滌印跡，并在具有增強化學發光的Kodak X-omat LS膜(Eastman Kodak Company，NewHaven，CT)上顯現免疫反應性蛋白質(Amersham Biosciences，Piscataway NJ)。使用柯達ID圖像分析軟件進行密度測量。

1.6測量細胞內活性氧(ROS) 將A549細胞(7×104個/孔)接種于96孔微量培養板上并培養24 h，然后用目標化合物處理24 h。 使用氧化還原敏感染料2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針評估細胞內ROS水平。 將所有實驗細胞在PBS中洗滌兩次，并用20 mmol/L DCFH-DA在黑暗中染色30 min。細胞用1%Triton X-100溶解后，在485 nm的波長下測量熒光，使用熒光光譜儀(HTS7000，Perkin Elmer，Boston，MA)的發射波長為530 nm。ROS水平以對照的百分比表示。

1.7統計分析 采用SPSS19.0進行One-way ANOVA分析。

2 結 果

2.1紫草素對A549細胞活性抑制 相比于對照組(0 μmol/L)，用紫草素處理的A549細胞存活率明顯下降(P<0.001),2、4、8、16 μmol/L的紫草素作用24 h后，肺腺癌A549細胞的生存率分別為(94.84±2.08)%、(87.98±1.93)%、(62.79±2.46)%、(26.36±2.83)%；紫草素濃度梯度下RIP1和RIP3蛋白水平變化見圖1；實驗結果表明紫草素抑制A549細胞活性與濃度有關。基于以上數據，確定的紫草素半數致死量濃度(IC50)為10.5 μmol/L。選擇10 μmol/L為藥物濃度。

圖1 0、10 μmol/L紫草素作用后A549細胞變化

2.2紫草素以壞死的方式誘導A549細胞死亡 紫草素預先處理A549細胞，然后經Annexin V/PI 雙染色法染色，最后流式細胞學結果為：活細胞(即Annexin V-/PI-)的數量明顯下降(P<0.001)；凋亡細胞(Annexin V+/PI-)未見明顯變化(P=0.178)；但表現為Annexin V+/PI+和Annexin V-/PI+的壞死細胞數量較對照組明顯增加(P<0.001)(圖2)。與對照組(死亡率為0)相比，單加Nec-1組中肺腺癌A549細胞活性未見明顯變化，細胞死亡率為3.00%±0.64%；而在5 μmol/L紫草素組，該細胞活性受到抑制，細胞死亡率為24.72%±2.50%，而同時用150 μmol/L Nec-1預處理后的5 μmol/L紫草素組中，上述細胞的活性恢復，細胞死亡率為15.25%±2.77%；10 μmol/L紫草素組細胞的死亡率為76.34%±2.76%；而在150 μmol/L Nec-1預處理后，10 μmol/L紫草素組的細胞死亡率為65.51%±0.78%。與對照組(死亡率為0)相比，單加Gsk組中肺腺癌A549細胞活性未見明顯變化，細胞死亡率為2.96%±0.32%；而在5 μmol/L紫草素組，該細胞活性受到抑制，細胞死亡率為25.35%±1.39%，150 μmol/L Gsk預處理后的5 μmol/L紫草素組中，上述細胞的活性恢復，細胞死亡率為16.44%±1.87%；10 μmol/L紫草素組細胞的死亡率為76.62%±0.77%；而在150 μmol/L Gsk預處理后的10 μmol/L紫草素組細胞死亡率為65.86%±1.46%。

圖2 紫草素濃度梯度下肺腺癌細胞RIP1、RIP3蛋白表達

2.3紫草素作用下A549細胞中RIP1和RIP3高表達 A549細胞死亡與RIP1和RIP3表達增加相關。蛋白電泳顯示，紫草素預加工后的A549細胞中，RIP1和RIP3表達量顯著提高(圖3)。但應用Nec-1(150 μmol/L)預處理肺腺癌A549細胞，MTT法表明實驗組中Nec-1明顯地解除了紫草素對于肺腺癌A549的活性抑制，且蛋白電泳也支持上述結果。GSK(5 μmol/L)預處理細胞后，也得到類似的結果(圖3)。

2.4紫草素通過RIP1/RIP3來影響A549細胞ROS水平 使用DCFH-DA作為探針來檢測紫草素處理后A549細胞ROS水平較對照明顯升高(P<0.001)。應用NAC后，A549細胞內ROS水平下降顯著(P<0.001)。同樣使用Nec-1及GSK后也具有相近結果(圖4)。無論單獨應用Nec-1、GSK或NAC后，A549細胞中ROS較對照組均無明顯變化(均為1)；而在5 μmol/L紫草素處理后ROS水平升高，為150.44±3.469 4，同時Nec-1、GSK及NAC處理后ROS濃度明顯升高，分別為133.33±3.511 9、135.00±4.582 6和130.67±7.767 5；10 μmol/L紫草素處理后ROS水平升高，為231.67±2.081 7，同時Nec-1、GSK及NAC處理后ROS濃度明顯升高，分別為197.00±3.000 0、213.00±1.732 0和183.67±2.516 6。混合譜系激酶結構域樣蛋白(MLKL)參與ROS產生中，故MLKL蛋白水平變化隨ROS變化。故RIP1和RIP3與ROS表達有關(圖4)。

圖3 紫草素對A549細胞RIP1、RIP3蛋白表達的影響

圖4 紫草素通過RIP1/RIP3來影響A549細胞MLKL、RIP1、RIP3蛋白表達水平

3 討 論

Huang等〔8〕認為紫草素使RIP1表達量升高而使膠質瘤細胞死亡。Chen等〔12〕考慮紫草素誘導的RIP3變化在胰腺癌細胞的程序性壞死中發揮主要的作用。Fu等〔11〕證明紫草素致使結直腸癌細胞依賴RIP1和RIP3發生程序性壞死。

本研究表明：紫草素對于A549細胞具有殺傷作用，且與紫草素濃度有關，隨著其濃度升高，RIP1和RIP3的表達量增多。但其誘導腫瘤細胞死亡機制尚有爭議。Chen等〔12〕認為凋亡是紫草素誘導胰腺癌細胞死亡的方式；而在腦膠質瘤細胞及結直腸癌細胞里則主要以程序性壞死方式死亡〔8，11〕。這意味著紫草素可能通過不同的途徑在不同的腫瘤細胞中起作用。本文結果表明，A549細胞是以壞死為主要死亡形式；這與之前的報道一致〔13〕。

本文結果表明，程序性壞死的特異性抑制劑解除了紫草素的抑制作用，這一證據也支持紫草素誘導的壞死為程序性壞死。同時結合程序性壞死的特點：①形成由RIP1和RIP3組成的壞死體〔9〕；②壞死是其主要的形態學特征〔8〕，可見紫草素作用下的A549細胞發生了程序性壞死。

雖然RIP1和RIP3參與程序性壞死，但其下游信號仍然不清楚。Kim等〔13〕認為抑制自噬可以增強紫草素對A549細胞的殺傷作用，故自噬也可能是程序性壞死的下游通路。研究證明RIP1和RIP3均與ROS的產生相關〔16，17〕。而MLKL能夠調節線粒體的功能參與ROS 的表達〔18〕。本文結果證實紫草素誘導RIP1和RIP3表達量升高導致A549細胞內ROS異常表達，打破細胞內氧化還原平衡，最終導致細胞死亡。

綜上，紫草素具有殺傷肺腺癌細胞的作用，且RIP1和RIP3可視為肺腺癌的靶向蛋白之一，這為肺腺癌的治療提供了新的理論依據。