HHIP基因多態(tài)性與新疆蒙古族慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)系研究

馬程遠(yuǎn)，關(guān)鍵，張中宏，梁文晉，任俠，王耀林

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是呼吸系統(tǒng)的一種多發(fā)病與常見(jiàn)病，其特征性表現(xiàn)為持續(xù)性呼吸道癥狀、氣流受限；通常氣流受限由有毒顆?；驓怏w導(dǎo)致的氣道、肺泡異常所引起。目前COPD的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確。但導(dǎo)致COPD發(fā)生的危險(xiǎn)因素主要為環(huán)境因素與遺傳因素，兩者相互作用。環(huán)境因素包括吸煙、生物燃料煙霧、空氣污染、職業(yè)性暴露等。而遺傳因素也是COPD發(fā)生、發(fā)展重要的內(nèi)在原因。CHO等［1］進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)HHIP、FAM13A、CHRNA3、RIN3、MMP12、TGFB2基因與COPD有相關(guān)性。WANG等［2］發(fā)現(xiàn)HHIP基因rs12504628位點(diǎn)與COPD患者第1 秒用力呼氣末容積/用力肺活量比值（FEV1/FVC）具有相關(guān)性，提示在中國(guó)漢族人群中HHIP基因與COPD易感性相關(guān)。新疆聚居著維吾爾族、哈薩克族、蒙古族、柯?tīng)柨俗巫宓?7個(gè)民族，而COPD也是新疆常見(jiàn)疾病。HHIP基因多態(tài)性和新疆蒙古族COPD易感性是否存在相關(guān)性尚未得知。因此，本研究分析新疆蒙古族的COPD患者和健康志愿者的HHIP基因rs1489758、rs1492820位點(diǎn)基因頻率，探討HHIP基因多態(tài)性和新疆蒙古族COPD易感性之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年1月—2017年6月新疆巴音郭楞蒙古自治州醫(yī)院和新疆博爾塔拉蒙古自治州醫(yī)院診斷為COPD的蒙古族患者259例（病例組），男186例，女73例；平均年齡（69.2±10.5）歲。COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》［3］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，有吸煙、環(huán)境污染等高危因素接觸史，臨床癥狀：咳嗽、咳痰、氣喘2年以上，每年持續(xù)3個(gè)月以上，需行肺功能檢查；使用支氣管擴(kuò)張藥物后，F(xiàn)EV1/FVC＜70%。選取同期體檢中心的體檢健康的蒙古族志愿者245例（對(duì)照組），男160例，女85例；平均年齡（67.6±9.8）歲。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)長(zhǎng)期咳嗽、咳痰、氣喘病史，肺功能正常（FEV1/FVC≥70%）。排除支氣管擴(kuò)張、支氣管哮喘、肺結(jié)核、肺癌、肺栓塞等呼吸系統(tǒng)疾病。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.48，t=1.77；P=0.12、0.08）。本研究經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 肺功能測(cè)定 研究對(duì)象統(tǒng)一使用全自動(dòng)肺功能測(cè)定儀（美國(guó)Medgraphics公司），由統(tǒng)一規(guī)范培訓(xùn)的醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行檢測(cè)。首先將基本資料（如姓名、年齡、性別、身高、體質(zhì)量、人種等）輸入肺功能測(cè)定儀，測(cè)定研究對(duì)象的FEV1占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%）、FVC及FEV1/FVC，連續(xù)重復(fù)檢測(cè)3次（期間每次間隔休息1 min），選取最大的結(jié)果記錄。

1.2.2 DNA提取 患者均抽取外周靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝混勻，-80 ℃保存。采用天根生化科技（北京）有限公司提供試劑盒（離心柱型）提取DNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。應(yīng)用NanoDrop-2000核酸蛋白測(cè)序儀測(cè)試DNA濃度及純度。

1.2.3 基因多態(tài)性檢測(cè) （1）引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank提供的基因序列，應(yīng)用Primer 4軟件對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，上述過(guò)程由上海天昊生物科技有限公司完成。rs1489758位點(diǎn)引物序列F5'-TTACACTTGCCGAGGCCATATTC-3'，R3'-GAAGGCACCAACGAGGAGTTTG-5'；rs1492820 位 點(diǎn)引 物 序 列F5'-CCTGCCATGAAGTCCCAATGAG-3'，R3'-GCTGCTCACTGAATTTTTCCTGGT-5'。2個(gè) 位 點(diǎn)擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為349 、285 bp。（2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系（10 μl）包含1×GC-I buffer（Takara.），0.3 mmol/L dNTP，3.0 mmol/L Mg2+，1 U HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc.），1 μl樣 本DNA和1 μl多重PCR引物。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃2 min。以下過(guò)程循環(huán)11次：變性94 ℃ 20 s，退火65℃ 40 s，延伸72 ℃ 1.5 min，循環(huán)每次降低0.5 ℃。以下過(guò)程循環(huán)24次：變性94 ℃ 20 s，退火59 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 1.5 min。延伸 72 ℃ 2 min，4 ℃保存。（3）PCR產(chǎn)物純化：在10 μl PCR產(chǎn)物加5 U SAP酶、2 U Exonuclease I酶，37 ℃溫浴1 h，75 ℃滅活15 min。（4）延伸反應(yīng)：延伸反應(yīng)體系（10 μl）包含5 μl SNaPshot Multiplex Kit（ABI），2 μl純化多重PCR產(chǎn)物，1 μl延伸引物混合物，2 μl超純水。延伸引物濃度：2個(gè)位點(diǎn)均為1.6 μmol/L。延伸過(guò)程：變性96 ℃ 1 min；以下過(guò)程循環(huán)28次：變性96 ℃ 10 s，退火55 ℃ 5 s，延伸60 ℃ 30 s，4 ℃保存。（5）延伸產(chǎn)物純化：10 μl延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶，37 ℃溫浴1 h，75 ℃滅活15 min。（6）延伸產(chǎn)物上ABI3730XL測(cè)序儀：取0.5 μl純化后延伸產(chǎn)物，0.5μl Liz120 SIZE STANDARD，9 μl Hi-Di混勻，95 ℃變性5 min上ABI3730XL測(cè)序儀，采 用 GeneMapper 4.1（AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA）分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；遺傳平衡檢驗(yàn)采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析COPD的影響因素。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) HHIP基因rs1489758、rs1492820位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（SNP）分型結(jié)果：病例組259例，rs1489758位點(diǎn)分型失敗16例，rs1492820位點(diǎn)分型失敗15例；對(duì)照組245例，rs1489758、rs1492820位點(diǎn)分型失敗各1例。rs1489758、rs1492820位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（χ2=2.24、0.61，P=0.13、0.43）。

2.2 病例組HHIP基因rs1489758、rs1492820位點(diǎn)不同基因型患者的肺功能比較 HHIP基因rs1489758、rs1492820位點(diǎn)不同基因型患者的FEV1%比較，差異有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（p＜0.05）。HHIP基 因 rs1489758、rs1492820位點(diǎn)不同基因型患者的FEV1/FVC比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表1、2）。

表1 病例組HHIP基因rs1489758位點(diǎn)不同基因型患者的肺功能比較（，%）Table 1 Comparison of pulmonary function parameters in patients in the case group by the genotype of rs1489758 at the HHIP gene locus

表1 病例組HHIP基因rs1489758位點(diǎn)不同基因型患者的肺功能比較（，%）Table 1 Comparison of pulmonary function parameters in patients in the case group by the genotype of rs1489758 at the HHIP gene locus

注：FEV1%=第1 秒用力呼氣末容積占預(yù)計(jì)值百分比，F(xiàn)EV1/FVC=第1 秒用力呼氣末容積與用力肺活量比值

基因型 例數(shù) FEV1% FEV1/FVC GG 171 60.1±8.7 57.0±5.8 GT 67 59.1±8.1 57.7±4.4 TT 5 49.5±5.5 56.5±3.6 F值 4.71 0.47 P值 0.01 0.62

表2 病例組HHIP基因rs1492820位點(diǎn)不同基因型患者的肺功能比較（，%）Table 2 Comparison of pulmonary function parameters in patients in the case group by the genotype of rs1492820 at the HHIP gene locus

表2 病例組HHIP基因rs1492820位點(diǎn)不同基因型患者的肺功能比較（，%）Table 2 Comparison of pulmonary function parameters in patients in the case group by the genotype of rs1492820 at the HHIP gene locus

基因型 例數(shù) FEV1% FEV1/FVC AA 67 57.8±9.3 57.1±6.2 AG 127 60.5±7.6 57.4±5.1 GG 50 58.7±9.6 56.8±5.3 F值 3.13 0.26 P值 0.04 0.77

2.3 HHIP基因rs1489758、rs1492820位點(diǎn)基因型與等位基因分布比較 病例組與對(duì)照組HHIP基因rs1489758、rs1492820位點(diǎn)基因型、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05，見(jiàn)表3、4）。

表3 HHIP基因rs1489758位點(diǎn)基因型、等位基因分布比較〔n（%）〕Table 3 Comparison of patterns of genotype and allele frequencies of rs1489758 at the HHIP gene locus

2.4 COPD影響因素的Logistic回歸分析 以是否患COPD（否=0，是 =1）為因變量，以rs1489758位點(diǎn)多態(tài)性（賦值：GG=0，GT=1，TT=2；G=0，T=1）、rs1492820位點(diǎn)多態(tài)性（賦值：AA=0，AG=1，GG=2；A=0，G=1）為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，rs1489758位點(diǎn)基因型GT、等位基因T和rs1492820位點(diǎn)基因型GG、等位基因G是發(fā)生COPD的影響因素（p＜0.05，見(jiàn)表 5）。

表4 HHIP基因rs1492820位點(diǎn)基因型、等位基因分布比較〔n（%）〕Table 4 Comparison of patterns of genotype and allele frequencies of rs1492820 at the HHIP gene locus

表5 COPD影響因素的Logistic回歸分析Table 5 Logistic regression analysis of COPD

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，HHIP基因是COPD的保護(hù)性基因，該基因缺失將增加COPD的風(fēng)險(xiǎn)［4］。典型Hedgehog（Hh）信號(hào)通路由成熟的Hh配基激活的Hh信號(hào)肽（SHh、IHh、DHh）-膜 蛋 白 受 體 PTCH（PTCH1、PTCH2）-跨膜蛋白SMO-融合阻抑蛋白SUFU-核轉(zhuǎn)錄因子Gli（Gli1、Gli2、Gli3）構(gòu)成。脊椎動(dòng)物細(xì)胞中，無(wú)Hh配基時(shí)，PTCH阻止SMO轉(zhuǎn)移至纖毛，抑制SMO活性，SUFU與Gli2/3A形成抑制復(fù)合物，Gli2/3A被水解成具有抑制形式的Gli2/3R，抑制下游基因表達(dá)。而成熟的Hh配基和PTCH結(jié)合后，解除PTCH對(duì)SMO的抑制，SMO則轉(zhuǎn)移到纖毛上，使Gli2/3A從抑制復(fù)合物上解離，激活下游基因的表達(dá)。研究顯示，異常Hh信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展，肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等的SHh或IHh轉(zhuǎn)錄上調(diào)［5］。研究發(fā)現(xiàn)Hh配基高表達(dá)對(duì)Hh信號(hào)通路過(guò)度異常激活同樣會(huì)造成COPD的發(fā)生、發(fā)展［6］。HHIP基因可以與PTCH競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Hh配基，負(fù)反饋調(diào)節(jié)Hh信號(hào)通路。

近年HHIP基因已成為研究熱點(diǎn)。許多國(guó)家對(duì)不同種族HHIP基因與COPD關(guān)系進(jìn)行了研究。波蘭315例COPD患者與330例吸煙者對(duì)照發(fā)現(xiàn)HHIP基因rs1542725位點(diǎn)多態(tài)性可增加COPD發(fā)?。?］。挪威PILLAI等［8］對(duì)823例COPD患者與810例吸煙者對(duì)照發(fā)現(xiàn)了HHIP基因rs13118928位點(diǎn)與肺功能FEV1%有關(guān)。中國(guó)WANG等［2］對(duì)680例COPD患者和687例健康對(duì)照者研究，發(fā)現(xiàn)HHIP基因rs12504628位點(diǎn)和FEV1/FVC有相關(guān)性。成芳娟等［9］對(duì)HHIP基因多態(tài)性與新疆哈薩克族COPD易感性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示rs13118928、rs1828591位點(diǎn)與新疆哈薩克族COPD易感性無(wú)相關(guān)性。任俠等［10］對(duì)HHIP基因多態(tài)性與新疆維吾爾族COPD易感性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示rs1828591、rs12504628位點(diǎn)基因型與FEV1%有關(guān)。本研究采用SNaPshot分型技術(shù)檢測(cè)新疆蒙古族259例COPD患者與245例健康志愿者，結(jié)果顯示HHIP基因rs1489758、rs1492820位點(diǎn)與COPD易感性有關(guān)。病例組HHIP基因rs1489758位點(diǎn)基因型GT、等位基因T低于對(duì)照組，可能降低發(fā)生COPD的風(fēng)險(xiǎn)。病例組HHIP基因rs1492820位點(diǎn)不同基因型GG、等位基因G分布高于對(duì)照組，可能增加發(fā)生COPD的風(fēng)險(xiǎn)。HHIP基因rs1489758、rs1492820位點(diǎn)基因型與FEV1%有關(guān)。上述國(guó)內(nèi)外研究得出部分HHIP基因SNP位點(diǎn)與COPD易感性相關(guān)，但同一有關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的SNP在不同國(guó)家、不同民族的結(jié)果不盡相同［2，7-10］。

HHIP基因SNP位點(diǎn)眾多，本研究根據(jù)GWAS選取了其中的2個(gè)（rs1489758、rs1492820），而HHIP基因其他位點(diǎn)與新疆蒙古族COPD易感性的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道，其關(guān)系尚不清楚。新疆地廣人稀，交通不便，對(duì)樣本收集造成影響，導(dǎo)致總樣本量較少，無(wú)法更好闡釋HHIP基因SNP與全部新疆蒙古族COPD易感性關(guān)系。

綜上所述，HHIP基因rs1489758、rs1492820位點(diǎn)多態(tài)性可能與新疆蒙古族COPD的發(fā)生有關(guān)。但今后還需要大樣本、多國(guó)家、多民族的病例對(duì)照研究，形成更完整的信息數(shù)據(jù)庫(kù)，更全面揭示HHIP基因多態(tài)性和COPD易感性的關(guān)系，為未來(lái)治療COPD提供新的方向。

作者貢獻(xiàn)：馬程遠(yuǎn)進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、研究的實(shí)施與可行性分析、數(shù)據(jù)收集與整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、結(jié)果的分析與解釋、撰寫(xiě)論文、論文修訂；關(guān)鍵進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析、論文修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；張中宏、梁文晉、任俠進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析、數(shù)據(jù)收集與整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；王耀林進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

本文無(wú)利益沖突。