以磷酸二氫根為軸向配體的鉑ビ前藥的設(shè)計(jì)、合成和抗癌活性測(cè)試

高安麗 熊慶豐 姜 婧＊, 余 娟 樓麗廣 劉偉平＊,

(1昆明貴金屬研究所，稀貴金屬綜合利用新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650106)

(2中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所腫瘤藥理研究室，上海 201203)

目前化療仍是治療晚期惡性腫瘤的最基本手段之一，而以順鉑和奧沙利鉑為代表的鉑類(lèi)藥在癌癥的化療中起著重要的作用，是治療肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和肝癌的一線化療藥物。然而，鉑類(lèi)藥物的臨床應(yīng)用一直存在毒副作用大和出現(xiàn)耐藥性?xún)纱髥?wèn)題[1]。因此，發(fā)展高效、低毒的新型鉑類(lèi)抗癌藥物是無(wú)機(jī)藥物化學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向，其中，鉑ビ前藥是研究的熱點(diǎn)。鉑ビ前藥屬于低頻八面體d6鉑ビ配合物，與鉑ギ配合物相比，動(dòng)力學(xué)上具有很高的穩(wěn)定性，在血液中不進(jìn)行水解作用或配體交換反應(yīng)，從而減小與生物大分子之間副反應(yīng)，降低毒副作用。鉑ビ)配合物一旦進(jìn)入癌細(xì)胞，易被還原成鉑ギ原藥而活化，如圖1所示。同時(shí)，還可以通過(guò)選擇軸向配體Y來(lái)調(diào)控鉑ビ前藥的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(如溶解度、還原電位、分布)，獲得較理想的抗癌作用[2-5]。

圖1 鉑ビ前藥的還原活化反應(yīng)Fig.1 Reductive activation of platinumビprodrugs

最近30年來(lái)，先后有4種鉑ビ配合物進(jìn)入臨床試驗(yàn)，分別是四鉑(tetraplatin)、異丙鉑(iproplatin)、賽特鉑(satraplatin)和LA-12(圖2)，均未獲準(zhǔn)上市，主要原因與水溶性低、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)差，毒性大有關(guān)[6]。我國(guó)南京大學(xué)郭子建教授領(lǐng)銜的團(tuán)隊(duì)、東南大學(xué)茍少華教授以及中山大學(xué)毛宗萬(wàn)教授等在鉑類(lèi)抗癌藥物方面也取得了重要的進(jìn)展[7-11]。鉑類(lèi)藥物也一直是本研究團(tuán)隊(duì)的重點(diǎn)研究方向[12-14]。

磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的無(wú)機(jī)酸，其pKa1=2.12，酸度與醋酸酐相當(dāng)，具有一定的配位能力。磷酸還是細(xì)胞構(gòu)建核酸的主要成分之一，癌細(xì)胞旺盛的增殖對(duì)磷酸的需求明顯高于正常細(xì)胞，攝取磷酸的能力強(qiáng)，已有研究表明：藥物分子中連接磷酸基團(tuán)，可能有助于藥物向癌細(xì)胞內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)，提高藥物對(duì)癌細(xì)胞的選擇性；同時(shí)，磷酸的引入可以提高藥物的親水性，是提高藥物溶解度的有效手段[15-17]?；谶@些考慮，我們?cè)O(shè)計(jì)出如圖3所示的鉑ビ前藥(其中，A2為氨/胺配體，X2為氯離子或二羧酸根)，并進(jìn)行了一系列的化學(xué)合成試驗(yàn)工作，就目前我們實(shí)驗(yàn)室已有的合成路線和工藝，嘗試了很多次，只獲得結(jié)構(gòu)明確的2種配合物，分別標(biāo)記為CPL-1501和CPL-1504。本文將報(bào)道這2種鉑ビ配合物的合成、結(jié)構(gòu)表征和抗癌活性。

圖2 進(jìn)入臨床研究的鉑ビ前藥Fig.2 Chemical Structures of platinumビagents that have undergone clinical trials

圖3 以磷酸為軸向配體的鉑ビ前藥的設(shè)計(jì)理念Fig.3 Design concept of platinumビprodrugs with dihydrogen phosphate as axial ligand

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

85%(w/w)磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和30%(w/w)過(guò)氧化氫均購(gòu)自西隴化工股份有限公司；順鉑、奧沙利鉑購(gòu)自昆明貴研藥業(yè)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水，22.6℃電阻率不小于3.7 MΩ·cm。Vario ELⅢ型元素分析儀，BRUKER Tensor-27傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；BRUKER DRX-500核磁共振儀(13C NMR的化學(xué)位移以TMS內(nèi)標(biāo)，31P NMR的化學(xué)位移以85%磷酸為內(nèi)標(biāo))；冷凍干燥器(DRC-1000/FDU-1100)；BAS100電化學(xué)工作站。

1.2 合 成

1.2.1 CPL-1500中間體的合成

中間體 cis，trans，cis-[Pt(NH3)2(OH)2Cl2]按照參考文獻(xiàn)[18]合成。即在60℃下，將過(guò)氧化氫(30%，252 mL)逐滴加入順鉑 (8.401 g，27.93 mmol)水溶液中(252 mL)。攪拌反應(yīng)4 h后，將得到的亮黃色溶液自然冷卻至室溫，靜置過(guò)夜，析出黃色晶體。過(guò)濾收集，并用冰水洗滌，真空干燥。將干燥后的黃色晶體在沸水中進(jìn)一步重結(jié)晶提純后，得到亮黃色晶體4.77 g，產(chǎn)率為51%。按照熾灼殘?jiān)鼨z查法(中國(guó)藥典2015年版)測(cè)定金屬鉑的含量為58.2%，與計(jì)算值(58.38%)一致。

1.2.2 CPL-1501配合物的合成

準(zhǔn)確稱(chēng)取 2.061 g(6.17mmol)的 cis，trans，cis-[Pt(NH3)2(OH)2Cl2]，加入85%磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.678 g(5.88 mmol，相當(dāng)于化學(xué)計(jì)量的95%)，攪拌混合后，加入50 mL水，在60℃下攪拌反應(yīng)20 h，減壓濃縮至近干，再加入100 mL水溶解，冷卻至4℃，過(guò)濾除去未反應(yīng)黃色不溶物 cis，trans，cis-[Pt(NH3)2(OH)2Cl2]，濾液冷凍干燥，得到黃色晶狀粉末2.36 g，產(chǎn)率為93%。31P NMR(D2O，500 MHz)：δ 2.92(H2PO4-)；IR(KBr)：3443(s，νO-H)，3 265，3 176(s，νN-H)，1 632，1 564(m，δa(NH3))，1 321(m，νP=O)，1 040，1 009(m，νP-O)，558，537，521(w，νPt-N，νPt-O)。 元素分析按 N2H9PO5Cl2Pt計(jì)算(%)：N 6.76，H 2.17，Pt 47.1； 實(shí)測(cè)值 (%)：N 6.68，H 2.16，Pt 47.3，其中金屬鉑含量采用經(jīng)典的還原重量法測(cè)定。

1.2.3 CPL-1503中間體的合成

中 間 體 cis，trans，cis-[Pt((1R，2R)-DACH)(OH)2(C2O4)]按照參考文獻(xiàn)[19]合成。即將奧沙利鉑(6.001 g，15.11 mmol)加入水(600 mL)中，攪拌并升溫至溶液澄清，繼續(xù)攪拌30 min，然后自然冷卻至室溫，加入過(guò)氧化氫(30%，21.52 mL)。加入完畢后，室溫下攪拌反應(yīng)5 h，反應(yīng)過(guò)程中有青白色固體析出。過(guò)濾收集此固體，并用冰水洗滌，真空干燥。將干燥后的固體在沸水中重結(jié)晶提純，得到白色結(jié)晶狀固體5.75 g，產(chǎn)率為88.32%。按照熾灼殘?jiān)鼨z查法測(cè)定金屬鉑的含量為45.2%，與計(jì)算值(45.24%)一致。

1.2.4 CPL-1504配合物的合成

準(zhǔn)確稱(chēng)取 2.406 g(5.58 mmol)的 cis，trans，cis-[Pt((1R，2R)-DACH)(OH)2(C2O4)]，加入 85%磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.637 g(5.52 mmol，相當(dāng)于化學(xué)計(jì)量的 99%)，攪拌混合后，在60℃下加入30 mL水?dāng)嚢璺磻?yīng)20 h，減壓濃縮至近干，再加入50 mL攪拌溶解，冷卻至4℃，過(guò)濾除去少量的不溶物，濾液冷凍干燥，得到白色晶狀粉末2.75 g，產(chǎn)率為97%。13C NMR(DMSO，500 MHz)：δ 165(COO-)，61,30，23(cyclohexyl)。31P NMR(D2O，500 MHz)：δ 2.91(H2PO4-)。 IR(KBr，cm-1)：3 434(s，νO-H),3 201,3 092(m，νN-H),2 940,2 865(w，νC-H),1 721(vs，νas(COO-))，1 372(s，νa(COO-)),1 021，981(m，νP-O)，573，509(w，νPt-N，νPt-O)。 元素分析按 C8H17N2O9PPt計(jì)算(%)：C 18.8，H 3.32，N 5.48，Pt 38.2；實(shí)測(cè)值(%)：C 18.5，H 3.36，N 5.44，Pt 38.0， 其中金屬鉑含量采用經(jīng)典的還原重量法測(cè)定。

1.3 水溶性和穩(wěn)定性的測(cè)定

采用中國(guó)藥典中收錄的逐步加入溶劑的方法測(cè)定溶解度。水溶液穩(wěn)定性采用核磁共振譜的方法測(cè)定：取2 mg樣品，溶于0.5 mL D2O中，室溫放置，不同時(shí)間點(diǎn)采用Bruker DRX-500測(cè)定31P NMR，比較各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的31P NMR與起始的31P NMR變化。

1.4 循環(huán)伏安測(cè)定

將鉑ビ前藥溶于去離子水中,制成1.0 mmol·L-1溶液，并使用0.05 mmol·L-1Na2SO4作支持電解質(zhì)。使用BAS100電化學(xué)分析器測(cè)定循環(huán)伏安圖，掃描速率為100 mV·s-1，恒定電位為0.9 V，起始電位為0.9 V，工作電極為玻璃碳電極，參比電極為Ag/AgCl，輔助電極為鉑絲。測(cè)試前通入5 min氮?dú)庖耘懦芤褐醒鯕狻?/p>

1.5 體外抗癌活性

RPMI-1640、F-12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco BRL公司，胎牛血清購(gòu)自SAFC公司，SPECTRA MAX 190型酶標(biāo)儀購(gòu)自Molecular Devices公司,SRB購(gòu)自Sigma公司。人肝癌細(xì)胞株(SMMC-7721)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A-549)、人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、人結(jié)腸癌細(xì)胞株(SW480)、人卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3)和耐受順鉑的卵巢癌癌細(xì)胞株(SKOV3/DDP)均購(gòu)自ATCC。

應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞(SMMC-7721，A-549，MCF-7，SW480，SKOV3，SKOV3/DDP)增殖生長(zhǎng)的抑制作用。主要步驟如下：接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期懸浮細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，加入不同濃度的藥物，每個(gè)濃度設(shè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)相應(yīng)濃度的溶媒對(duì)照。腫瘤細(xì)胞在37℃、5%(V/V)CO2條件下培養(yǎng)72 h后，加入MTT工作液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，計(jì)算抑制率，根據(jù)各濃度抑制率，根據(jù)非線性回歸方法計(jì)算半數(shù)抑制濃度 IC50。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(Inhibitory rate)計(jì)算公式如下：

Inhibitory rate=(ODcontrol-ODdosing)/ODcontrol×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 以磷酸二氫根為軸向配體的Ptビ前藥的合成與表征

兩種鉑ビ前藥均是以原型藥物順鉑或奧沙利鉑為起始原料，通過(guò)雙氧水氧化制備出中間體cis，trans，cis-[Pt(A)2(OH)2(X)2]，再與磷酸在水溶液起中和反應(yīng)制備得到的。由于中間體cis，trans，cis-[Pt(A)2(OH)2(X)2]的水溶性非常低，我們通過(guò)控制磷酸的加入量少于理論計(jì)算量來(lái)獲得較純的目標(biāo)產(chǎn)物CPL-1501和CPL-1504，合成路線見(jiàn)圖4。

目標(biāo)產(chǎn)物通過(guò)NMR、IR和元素分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。元素分析結(jié)果與理論值吻合良好。IR譜圖在1 032～1 047 cm-1范圍表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的P=O伸縮振動(dòng)峰；981～1 040 cm-1范圍內(nèi)的中等強(qiáng)度峰則歸屬于P-O伸縮振動(dòng)；Pt-N和Pt-O的特征峰在509～573 cm-1范圍，為弱的吸收峰。2種化合物在3 092～3 265 cm-1處均表現(xiàn)出氨(胺基)配體N-H的伸縮振動(dòng)，為寬的振動(dòng)帶。2種目標(biāo)配合物31P NMR譜圖中磷原子化學(xué)位移均在2.92左右，對(duì)應(yīng)于H2PO42-上磷原子的振動(dòng)峰。而CPL-1504的13C NMR中，δ=165處的峰為羧基中碳原子的振動(dòng)峰；23、30和61處3個(gè)峰分別為環(huán)己二胺配體的環(huán)己基上3種碳原子的峰。

常溫下，測(cè)得CPL-1501在水中的溶解度約為10 mg·mL-1，CPL-1504 在水中的溶解度約為 50 mg·mL-1。此外，CPL-1501配合物的D2O溶液在48h內(nèi)的31P NMR無(wú)明顯變化，說(shuō)明其在水溶液中具有很好的穩(wěn)定性，能夠維持穩(wěn)定至少48 h，明顯高于順鉑(t1/2＜30 min)，滿足作為注射藥物使用的要求。測(cè)得各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CPL-1501在D2O中31P的化學(xué)位移值如表1所示。

圖4 目標(biāo)化合物的合成路線圖Fig.4 Synthesis routes of the target compounds

表1 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得31P NMR的化學(xué)位移Table 1 Chemical shift of31P NMR tested of each time with respect to phosphoric acid

2.2 體外抗癌活性

2.2.1 CPL-1501的體外抗癌活性

以順鉑、卡鉑為陽(yáng)性對(duì)照，采用MTT法測(cè)試了不同濃度的CPL-1501以及中間體CPL-1500對(duì)5種人癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制濃度，這5種癌細(xì)胞株分別為人肝癌細(xì)胞株(SMMC-7721)、人結(jié)腸癌細(xì)胞株(SW480)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A-549)、人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、人卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3)，它們是對(duì)鉑類(lèi)藥物比較敏感的瘤株，對(duì)應(yīng)的也是我們?nèi)祟?lèi)常見(jiàn)多發(fā)的惡性腫瘤。從濃度-細(xì)胞成活率的曲線計(jì)算出藥物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度IC50(表2)?？梢钥闯?，CPL-1501體外對(duì)癌細(xì)胞株生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，且整體抗癌活性與順鉑相當(dāng)、明顯高于卡鉑。而其中間體CPL-1500體外僅對(duì)人肝癌細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)有較高活性，對(duì)其他3株癌細(xì)胞沒(méi)有明顯的抑制活性。因此，在軸向引入一個(gè)磷酸作配體，可以加強(qiáng)鉑ビ前藥的抗癌活性，且可以取得與順鉑相媲美的效果。

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)配合物CPL-1501的抗癌作用，我們還采用MTT法測(cè)試并比較了它對(duì)耐受順鉑的卵巢癌癌細(xì)胞株 (SKOV3/DDP)生長(zhǎng)的抑制活性。 結(jié)果表明(表 3)，對(duì)于 SKOV3/DDP，CPL-1501抑制活性下降，耐藥指數(shù)與順鉑相等，提示CPL-1501與順鉑之間存在交叉耐藥，這與前人的相關(guān)耐藥機(jī)制產(chǎn)生的研究結(jié)論相符，即CPL-1501和順鉑與癌細(xì)胞的DNA作用生成了結(jié)構(gòu)完全一樣的加合物cis-(H3N)2Pt/DNA，抗癌性質(zhì)一致[20]。

表2 CPL-1500和CPL-1501的體外抗癌活性Table 2 In vitro anticancer activity of CPL-1500 and CPL-1501

表3 CPL-1501體外對(duì)耐藥細(xì)胞株的抗癌活性Table 3 In vitro anticancer activity of drug-resistant cell lines of CPL-1501

2.2.2 CPL-1504的抗癌活性

以順鉑、奧沙利鉑為陽(yáng)性對(duì)照，采用同樣的MTT法測(cè)試了不同濃度的CPL-1504以及中間體CPL-1503對(duì)3種人癌細(xì)胞株的抑制作用，計(jì)算IC50。結(jié)果表明(表4)：2種陽(yáng)性藥物對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)都表現(xiàn)出明顯的抑制活性，IC50都在～120 μmol·L-1范圍內(nèi)。但CPL-1504以及中間體CPL-1503對(duì)這3株癌細(xì)胞沒(méi)有明顯的抑制活性，活性明顯低于其原藥奧沙利鉑，這說(shuō)明發(fā)展對(duì)應(yīng)于奧沙利鉑的鉑ビ前藥無(wú)意義。

表4 CPL-1503和CPL-1504的體外抗癌活性Table 4 In vitro anticancer activity of CPL-1503 and CPL-1504

2.3 循環(huán)伏安測(cè)定

圖5 配合物CPL-1501和CPL-1504的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammograms of CPL-1501 and CPL-1504

如圖5所示，2種鉑ビ前藥的氧化還原過(guò)程均是不可逆的雙電子還原過(guò)程，因此，還原電勢(shì)為正向波的峰值(Ep)。由循環(huán)伏安圖測(cè)得CPL-1501的2個(gè)Ep值分別為0.16 V和-0.52 V，CPL-1504的2個(gè)Ep值分別為-0.51和-0.76 V。正向波的Ep值反映了鉑ビ還原為鉑ギ的難易度：軸配位為氯配體時(shí)，最容易還原；而軸配體為羥基時(shí)，最難還原。文獻(xiàn)報(bào)道已進(jìn)入臨床研究的2種鉑ビ前藥異丙鉑 (軸配體為羥基)和四鉑(軸配體為氯配體)的Ep值分別為-0.73和-0.09 V[21-23]。我們?cè)O(shè)計(jì)合成的目標(biāo)化合物 CPL-1501的還原電勢(shì)(-0.52 V)介于兩者之間，可以推測(cè)，在癌細(xì)胞中容易還原激活，表現(xiàn)出明顯的抗癌活性。但是，CPL-1504的還原電勢(shì)(-0.76 V)偏高，比較難還原，所以CPL-1504體外無(wú)明顯抗癌活性。

3 結(jié) 論

本文合成了一個(gè)第一代鉑類(lèi)抗癌藥順鉑的前藥CPL-1501，它具有水溶性較高、穩(wěn)定性好、抗癌活性與順鉑相當(dāng)?shù)膬?yōu)點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究和評(píng)價(jià)。目前，CPL-1501的結(jié)構(gòu)已獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利授權(quán)，我們正在評(píng)價(jià)其體內(nèi)抗癌活性和初步毒性。

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