帕金森病模型大鼠腦組織SPTLC2的表達研究

何曉燕　焦燕　李紅燕

[摘要] 目的 探究絲氨酸棕櫚酰轉移酶長鏈亞基2（SPTLC2）在帕金森病大鼠腦組織中的表達。 方法 采用注射6-羥基多巴胺制備帕金森病大鼠模型，將模型組分為三組：模型組（2周）、模型組（4周）、模型組（8周），同時設置正常組，采用異常不自主動作（AIM）評分法評定各組大鼠行為，同時記錄旋轉持續時間、啟動時間、劑峰旋轉圈數。HE染色法觀察大鼠腦組織變化，免疫組化法檢測大鼠腦組織中α突觸核蛋白的表達，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法測定大鼠腦組織中SPTLC2 mRNA表達，Western blot檢測大鼠腦組織中SPTLC2蛋白表達。 結果 模型組大鼠AIM評分、旋轉持續時間、啟動時間、劑峰旋轉圈數均高于正常組，隨著時間的延長，AIM評分、旋轉啟動時間、劑峰旋轉圈數逐漸升高，旋轉啟動時間逐漸降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。免疫組化染色顯示，正常組α突觸核蛋白陽性細胞數量較少，模型組陽性細胞數量明顯增多，且隨著時間的延長，陽性細胞數量逐漸升高。與正常組、模型組（2周）相比，模型組（4周）、模型組（8周）SPTLC2基因、蛋白表達量均升高；與模型組（4周）相比，模型組（8周）SPTLC2基因、蛋白表達量升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 SPTLC2可能參與帕金森病疾病的發生，通過上調SPTLC2基因、蛋白水平的表達來實現。

[關鍵詞] 帕金森病；絲氨酸棕櫚酰轉移酶長鏈亞基2；腦組織；模型

[中圖分類號] R742.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（a）-0021-04

Study on SPTLC2 expression level in brain tissue in the rat model of Parkinson disease

HE Xiaoyan JIAO Yan LI Hongyan

Department of Neurology， People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830001， China

[Abstract] Objective To explore the expression of serine palmitate transferase long chain subunit 2 （SPTLC2） in brain tissue in the rat model of Parkinson disease. Methods Parkinson rat model was prepared by injecting 6-hydroxy dopamine， and the rats were divided into three groups， 2-week model group， 4-week model group， 8-week model group， and normal group. Behaviors of rats in each group were assessed by using abnormal involuntary movement （AIM） scoring method. Rotation duration， starting time， the cycle number of agent peak were recorded meanwhile. HE staining method was used to observe the changes of brain tissue in rats， and the expression of α synuclein in rat brain tissue was detected by immunohistochemistry， and SPTLC2 and mRNA expression in brain tissue of rats was detected by using RT-PCR， and SPTLC2 protein expression in rat brain tissue was detected by Western blot. Results AIM score， rotation duration， starting time， agent peak rotation number in model group was higher than those in the normal group， and with the extension of time， AIM score， rotating start time， agent peak rotation number gradually increased， while the rotation starting time gradually decreased， with statistically significant differences （P < 0.05）. Immunohistochemical staining showed that the number of positive cells in the normal group was less than that in the normal group， and the number of positive cells in the model group increased significantly. The number of positive cells increased gradually with the extension of time. Compared with those in the normal group and 2-week model group， SPTLC2 gene and protein expression in 4-week and 8-week model group increased， and compared with 4-week model group， SPTLC2 gene and protein expression in 8-week model group increased， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion SPTLC2 may be involved in the pathogenesis of Parkinson disease， via up-regulating SPTLC2 gene and protein expression.

[Key words] Parkinson disease； Serine palmitate transferase long chain subunit 2； Brain tissue； Model

帕金森病屬于臨床神經系統疾病，調查顯示在我國發病率為1%～2%，近年來發病率逐年上升，患者認知、精神、行為、感覺出現障礙，給家庭社會造成巨大負擔，因此對帕金森病的研究十分必要[1]。最近研究顯示，絲氨酸棕櫚酰轉移酶長鏈亞基2（serine palmitoy ltransferase long chain base subunit 2，SPTLC2）在神經病變調控中發揮著重要作用，SPTLC2基因發生突變后導致軸突神經病變，喪失感覺[2]，以往對帕金森病病變機制探究較多[3]，但鮮見對其與SPTLC2基因間的關系進行探究。本研究通過制備帕金森病大鼠模型，采用不同生物學方法檢測腦組織中SPTLC2水平，旨在探究SPTLC2是否參與帕金森病發病過程。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SD大鼠26只（北京生命科學研究所，許可證號：SYXK2016-0012），均為SPF級動物，雄性。所有動物均在統一環境中進行飼養，溫度控制在（23±2）℃，濕度65%，自動光照控制（7：00～19：00照明），飼養時嚴格按照動物管理規則執行。

1.2 試劑與儀器

水合氯醛（北京百奧萊博科技有限公司，批號：305-17-6）；6-羥基多巴胺購自于美國Sigma公司，批號：162843；SYBR PCR Master Mix購自于日本Takara公司，批號：170219；兔抗大鼠α-synuclein蛋白、SPTLC2單克隆抗體一抗、HRP標記山羊抗兔二抗購自于美國Santa cruz公司，批號：161106、170826、170524；RNA提取試劑盒購自于北京生化科技有限公司，批號：213506；反轉錄試劑盒購自于日本Takara公司批號：170523；BCA測定試劑盒購自于上海碧云天生物科技有限公司，批號：170628；PVDF膜購自于美國Millpore公司批號：171021；380R高速冷凍離心機購自于德國Hettich公司；光學顯微鏡購自于上海光學儀器廠；熒光定量PCR儀購自于美國BioRed公司。

1.3 方法

1.3.1 帕金森病大鼠模型制備 取20只大鼠進行模型制備采用10%水合氯醛進行腹腔麻醉，將大鼠固定于定位儀上，進行頭部去毛，常規消毒，切開顱骨皮膚，剝離骨膜，使前囟暴露，用顱骨鉆鉆開顱骨，將6-羥基多巴胺用微量注射器注入黑質部，注射速率為1 mm/min，注射結束后醫用海綿填塞顱骨孔，縫合切口。

1.3.2 大鼠行為評定 采用異常不自主動作（abnormal involuntary movement，AIM）[4]評分法進行評定，設計前肢、口面部、軸性及運動4部分，根據情況嚴重程度分為5個等級：無，0分；偶爾出現，1分；經常出現，2分；持續存在，刺激后可停止，3分；持續存在，刺激后也無法停止，4分。同時記錄旋轉持續時間、啟動時間、劑峰旋轉圈數。

1.3.3 HE染色 分別于2、4、8周取6只大鼠處死后，取腦組織放入4%多聚甲醛中進行固定，常規制備石蠟切片，在70℃烤片機上加熱10 min，在二甲苯中進行2次脫蠟，每次10 min，在100%、95%、80%乙醇中分別脫水5 min，蒸餾水、磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，加入蘇木精進行染色10 min，浸入1%鹽酸后用蒸餾水進行沖洗。加入伊紅染液均染色3 min，依次在75%、85%、95%、100%中脫水2 min，加入二甲苯進行透明處理，滴加中性樹脂進行封片，將切片放置顯微鏡下進行觀察。

1.3.4 免疫組化法檢測大鼠腦組織中α突觸核蛋白的表達 將制備好的石蠟切片置于3%雙氧水-甲醇溶液中10 min，PBE溶液漂洗3次，95℃加熱10 min，蒸餾水沖洗后晾干，滴加α-突觸核蛋白一抗，置于4℃冰箱中過夜孵育，PBS清洗后晾干，加入HRP標記鏈霉素亂掰素溶液，室溫下孵育10 min，PBS漂洗后，滴加50 μL DAB顯色鮮室溫下染色2 min，蒸餾水沖洗后加入蘇木精復染，自來水沖洗后加入0.1%鹽水酒精溶液中浸泡1 min，在75%、85%、95%、100%梯度酒精中脫水2 min，加入二甲苯進行透明處理，滴加中性樹脂進行封片，將切片放置顯微鏡下進行觀察。

1.3.5 RT-PCR法測定大鼠腦組織中SPTLC2 mRNA表達 將腦組織在PBS緩沖液中清洗后用無菌剪刀剪碎后，提取組織總RNA并反轉錄為cDNA，RT-PCR引物由廣州Invitrogen公司合成。SPTLC2序列，F：GT？鄄ACGCCACGTCAATGTCAC；R：CAGCATCTCTCTCCC？鄄AAAGG。GAPDH序列，F：CTCATGACCACAGTCCAT？鄄GC；R：TTCAGCTCTGGGATGACCTT。反應體系：2×SYBR Mix10 μL；1cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，H2O 8 μL。在PCR儀上設置95℃ 2 min、95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 2 min，35個循環，72℃延伸10 min。反應后在CFX manager 3.0軟件進行數據分析，以GADPH作為內參基因按照2-ΔΔCt算法進行基因相對定量表達分析。

1.3.6 Western blot檢測大鼠腦組織中SPTLC2蛋白表達 將腦組織剪碎后加入蛋白裂解液在冰上反應30 min，3000 r/min離心10 min收集上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，制備8%分離膠、12.5%濃縮膠，蛋白上樣量統一為30 μg，當樣品進濃縮膠后電壓設置為80 V，進入分離膠后，電壓調整為120 V，電泳結束后轉移蛋白凝膠至PVDF膜上，轉膜反應在冰上進行，電壓設置為100 V，反應時間為1 h，加入TBST溶液進行清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗PVDF膜，加入一抗稀釋液（SPTLC2），4℃震蕩過夜，加入PBST溶液清洗3次，每次10 min，加入二抗稀釋液，室溫下孵育2 h，PBST清洗后在凝膠成像儀中觀察蛋白表達情況。

1.4 統計學方法

應用SPSS 21.0軟件對數據進行統計學分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間對比采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠行為評定結果

模型組大鼠AIM評分、旋轉持續時間、啟動時間、劑峰旋轉圈數均高于正常組，隨著時間的延長，AIM評分、旋轉啟動時間、劑峰旋轉圈數逐漸升高，旋轉啟動時間逐漸降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 大鼠腦組織HE染色及α突觸核蛋白的表達

腦組織HE染色顯示正常組大鼠神經元細胞染色呈橢圓形、圓形，細胞核染色較均勻呈藍紫色數量較多，模型組神經元細胞較小，顏色較淺，數量有所降低，隨著時間的延長，神經元細胞數量逐漸降低，模型組2周神經元細胞與正常組相比并無明顯差異。免疫組化染色顯示陽性細胞染色呈棕褐色，大部分細胞位于細胞核中，正常組陽性細胞數量較少，模型組陽性細胞數量明顯增多，且隨著時間的延長，陽性細胞數量逐漸升高。見圖1（封三）。

2.3 腦組織中SPTLC2基因、蛋白表達

與正常組、模型組（2周）比較，模型組（4周）、模型組（8周）SPTLC2基因、蛋白表達量均升高，與模型組（4周）比較，模型組（8周）SPTLC2基因、蛋白表達量升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。正常組與模型組（2周）比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖2。

3 討論

目前學者對帕金森病病變機制的研究主要包括以下幾方面：①機體內活性氧集團數量過多產生氧化應激反應，損傷細胞導致細胞死亡，且腦組織對此反應更敏感；②居住環境中存在較多工業化學物質能夠毒害神經，使神經元死亡；③線粒體功能異常，使機體細胞內能量生成出現障礙以及自由基水平升高，導致神經細胞凋亡；④隨著年齡增長，神經系統老化，多巴胺脫梭酶以及酪氨酸羥化酶活力較弱，神經元出現退變；⑤具有家族遺傳史，可能為顯性遺傳病變[5-6]。

本研究參考國外相關文獻制備帕金森病大鼠模型[7]，采用單點法注射6-羥基多巴胺注射后。有關研究表明，在制備模型后，腦組織中黑質內神經元會逐漸發生凋亡，神經元數量降低，突觸后膜多巴胺受體敏感性增強，導致損傷側多巴胺受體過度興奮動物會產生偏向健側的旋轉[8]。本研究結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠AIM評分、旋轉持續時間、啟動時間、劑峰旋轉圈數均高于正常組，表明在注射6-羥基多巴胺后能夠影響動物行為變化，發生旋轉。本研究還發現，隨著時間的延長，旋轉圈數也逐漸增加，與2、4周相比具有明顯的差異性，表明隨著時間的延長，大鼠腦部受傷越嚴重，這與國外相關研究相符[9]。

α突觸核蛋白由酸性氨基酸組成，親水性較高，在黑質、海馬、皮質等與記憶相關區域均表達，參與神經元的發育以及神經退變。國外報道顯示α突觸核蛋白能夠與多巴胺轉運體結合形成蛋白復合體，參與調控多巴胺的合成，機體內α突觸核蛋白由異常增多導致其調控功能降低，進而使突觸中多巴胺水平升高，使氧化應激反應增強，細胞毒性增強[10]。有學者研究顯示，α突觸核蛋白在神經細胞胞漿中常與tau蛋白結合形成神經纖維纏結淀粉樣斑塊，染色后可出現棕黑色沉淀[11]。本研究大鼠腦組織HE染色顯示，正常組大鼠神經元細胞染色呈橢圓形、圓形，細胞核染色較均勻呈藍紫色數量較多，模型組神經元細胞較小，顏色較淺，數量有所降低，隨著時間的延長，神經元細胞數量逐漸降低，提示帕金森病模型大鼠腦部受損后能夠導致神經元數量降低，免疫組化染色顯示，正常組α突觸核蛋白陽性數量較少，模型組陽性數量明顯增多，且隨著時間的延長，陽性細胞數量逐漸升高，提示帕金森病動物模型隨著時間的延長，α突觸核蛋白表達量升高，腦部受損嚴重導致病情加重。

SPT是神經酰胺從頭合成關鍵酶，SPTLC2屬于其中一個亞基，在神經細胞的誘導凋亡中發揮重要作用[12]。相關學者研究顯示SPTLC2雜合子小鼠中，鞘磷脂、神經酰胺的合成能力增加，細胞膜信號轉導作用增強，血清中脂蛋白水平升高，促進動脈粥樣硬化的發展[13]。還有研究顯示SPTLC2基因突變后能夠引發周圍神經突變，導致神經感覺喪失，如引發自主神經病變Ⅰ型[14]。國外學者研究顯示SPTLC2基因缺失型小鼠神經酰胺以及鞘磷脂含量明顯降低，胰島素敏感性增強，能夠有效抑制肥胖以及胰島素抵抗[15]。國內相關文獻研究顯示，通過過表達SPTLC2基因，能夠提高神經酰胺含量，促進細胞自噬、凋亡[16]。本研究通過不同檢測方法顯示，與正常組、模型組（2周）相比，模型組（4周）、模型組（8周）SPTLC2基因、蛋白表達量均升高，且隨著時間的延長，含量逐漸上升，表明SPTLC2基因、蛋白含量升高，能夠引起帕金森病大鼠疾病的加重，提示其可能參與神經病變的調控，但具體的機制還有待后續研究。

本研究也存在一定的局限性，注射的6-羥基多巴胺濃度梯度選取較少，后期需要設置不同梯度的6-羥基多巴胺進行進一步驗證，此外并未對SPTLC2基因影響神經病變的機制進行深入研究，僅比較表達水平的差異，后期還需深入探究。總之，SPTLC2可能參與帕金森病疾病的發生，并通過上調SPTLC2基因、蛋白水平的表達來實現。

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（收稿日期：2017-10-07 本文編輯：張瑜杰）