發酵法生產檸檬酸的研究進展

孫福新

檸檬酸是一類三元羧酸，3-羥基- 3-羧基戊二酸，即枸櫞酸。作為生物體代謝的主要產物之一，檸檬酸大多存在于生物體果實中，目前逐漸被應用于醫藥、食品及化工領域。檸檬酸全球消耗量正以每年7%的增長率增長，已躍居世界發酵產品產量的第二位。伴隨現代化生物技術的不斷發展與成熟，采用發酵法生產檸檬酸的技術及工藝條件已不斷成熟，并逐漸體現出簡單便捷、生產效率高等優勢，因此文章主要對檸檬酸的發酵工藝技術及其應用做了系統化的研究。

檸檬酸的發酵過程

檸檬酸的發酵生產用到了多種類型的微生物，如曲霉類、酵母類、細菌類等，其中酵母類生產檸檬酸可利用不同類型的碳源微生物，尤其是利用解脂亞羅酵母生產檸檬酸已得到廣泛的應用。然而，由于檸檬酸是一類能量代謝產物，因此需滿足代謝不平衡條件。其中，黑曲霉生產檸檬酸工藝以其產量高、操作簡便、副產物少被得到廣泛的應用，同時，對其發酵底無進行了優化，并將傳統誘變技術應用于生產中，使得檸檬酸產量大大提升。

黑曲霉檸檬酸代謝途徑見下圖1所示，在EMP作用下可將六碳糖轉化為丙酮酸，可進一步被氧化脫羧生成乙酰或被脫二氧化碳生成草酰乙酸，二者進一步可合成檸檬酸。作為TCA循環的代謝產物，檸檬酸的合成需借助酶的活性，而PEK受ATP及檸檬酸的抑制作用較強，但檸檬酸逐漸積累時，檸檬酸合成酶對乙酰的親和力也在逐步提升，因此，抑制烏頭酸水解酶的活性、破壞誘導機制是提升檸檬酸積累的關鍵措施。

發酵法生產檸檬酸的關鍵技術

檸檬酸發酵的方法。總體上講，檸檬酸的發酵方式包括了淺盤發酵工藝、固態及液態發酵工藝等類型，其中淺盤發酵工藝是檸檬酸發酵中最早的應用形式，而固態發酵工藝可充分利用農產品加工殘料，可降低生產成本并降低環境污染，但其肥料成分復雜，需進一步研究相關提取工藝；液態發酵工藝具有產量大、自控性能好、效率高等優勢，被廣泛應用。

檸檬酸發酵的工藝條件。檸檬酸發酵過程中，菌種類型、環境條件均對其有著重要影響，一般地，檸檬酸發酵菌種多由腐爛水果中提取而來，經過生物培養獲得優良菌種，并嚴格控制發酵過程中的溫濕度、PH條件，以營造利于發酵的最佳條件。黑曲霉菌最佳發酵溫度條件為30±1℃，溫度偏低將影響發酵效率，而溫度偏高時將產生一系列污染性雜質，甚至影響到霉菌的活性。而黑曲霉菌最佳發酵PH條件為3左右，易合成大量的檸檬酸并可有效抑制葡萄糖酸等雜質的產生。此外，培養液中的含氧量也會影響到黑曲霉菌的活性，而隨著發酵過程的進行含氧量是逐漸下降的，因此可通過攪拌的方式避免含氧量降低對霉菌活性的影響。最后，采用物理或化學方法對所獲得的檸檬酸進行提純處理，分離大分子蛋白雜質，即可得到純度較高的檸檬酸。

檸檬酸發酵工藝新進展。對于檸檬酸代謝途徑的研究表明，檸檬酸的合成速度受培養環境中二氧化碳的濃度影響較大，而在不同的二氧化碳濃度條件下，檸檬酸的發酵產量及速率也受到影響，因此二氧化碳既是代謝產物，又是生物合成反應的必備原料。實驗數據表明，當二氧化碳濃度高于0.90mol/L 時，將對微生物活性起到抑制作用。要想加快檸檬酸的發酵產量和質量，需要將更多的二氧化碳固定反應生成草酰乙酸，可借助基因工程提升丙酮酸的基因表達能力。此外，甲醇的存在可能會增加細胞對檸檬酸的滲透性，甲醇濃度的提升會影響到霉菌的活性，影響到檸檬酸的積累。

結論與展望

利用現代生物技術來提高檸檬酸發酵的產量和質量具有較高的技術可行性，尤其是近年來基因工程、細胞工程以及基因誘變技術的發展，對于檸檬酸發酵工藝的優化與發展提供了技術導向，開展檸檬酸生物合成途徑的研究，可以有效指導生物合成途徑的遺傳修飾，從而調節微生物對檸檬酸的生產，增加檸檬酸產量和提高檸檬酸的積累，也為提高其他有機酸產量的研究奠定了基礎。