實時熒光定量PCR技術在糧油轉基因成分檢測中的應用研究

覃茂峰

我國對于轉基因作物的成分有著嚴格的規定。當下常見的轉基因作物類型有很多，但是都需要對這些作物進行嚴格的基因檢測，才能流入市場。這就需要選擇合適的技術，能夠高效、快捷的加以應用。目前的轉基因作物檢測主要有以下三方面的內容。首先是判定轉基因作物的檢測；其次是對該作物品系的類型進行檢測；最后就是對其中的含量進行檢測。綜上，選擇實時熒光定量PCR技術是一種最為有效的檢測手段。

實時熒光定量PCR技術的基本原理

在糧油轉基因成分檢測時，要想了解其基因的拷貝數以及在特定組織中某些特定基因的表達量，那么就可以采用RT- PCR（RealTime PCR）技術。其基本原理是運用擴增反應過程中由循環產物產生的熒光信號來判定成分的。在實驗過程中，需要在熒光化學物質的引導下，隨時觀察反應產物的數量，并且隨著產物數量的不斷增多，熒光信號強度也會隨之增強。在這一過程中，我們可以根據監測物產量的變化，制定出一條實時熒光擴增曲線圖。這個曲線圖通常具有三個時期，第一時期為早期的背景擴增時期，第二時期為中期階段的指數擴增時期，第三時期為晚期的平臺期。

在比較檢測樣本的過程中，需要設定一個閾值，這一閾值不是固定不變的，而是人為設定的一個數值。通常情況下，會設置3至15個循環熒光信號，熒光閾值的缺省設置是其標準差的10倍以上。每個模板都具有一個Ct值，這一數值與起始拷貝數息息相關，二者呈反比的關系。在實際檢測的過程中，如果我們知道了標準品的起始拷貝數，那么就可以根據相關信息制定出一個標準曲線，進而通過Ct值獲得樣品的起始拷貝數。

轉基因大豆檢測的分析與結果

以轉基因抗除草劑大豆為例，選取適量的樣品與引物。本檢測中選擇來自巴西的轉基因大豆以及非轉基因大豆樣品。花椰菜花葉病毒35S啟動子、胭脂堿合酶NOS終止子作為引物。對上述樣品進行核酸的提取，將其置入核酸提取試劑盒中，分別采用CTAB法以及GMO試劑盒法對DNA進行制備。

準備階段完畢后，觀察PCR的反應。分別要觀察常規PCR的反應以及實時熒光定量PCR的反應。在常規PCR檢測中，先對大豆樣品的DNA進行擴增，在94℃的預變性環境下進行40個循環，時間為3min；繼續在94℃的變性環境下持續20s，降低溫度至54℃，時間持續40s，進而在72℃的溫度下延伸60s，最后持續3min完畢。對上述產物進行檢測，檢測工具為2%的瓊脂糖凝膠電泳，作用是將非目的DNA片段以及緩沖溶液等不需要的雜質去除干凈。

實時熒光定量PCR技術擴增實驗中，PCR的反應體系為25μL。其中包含反應緩沖液5μmol/L，樣品核酸2μmol/L以及引物2μL等。具體的擴增反應條件如下：在95℃的預變性環境下進行循環，時間為10min。繼續在95℃的變性環境下持續10s，降低溫度至55℃，持續時間為8s，升溫至72℃，持續時間為10s。以上過程共計40個循環。

將上述的兩種實驗反應制定出標準曲線，其中橫坐標為DNA初始濃度的對數值，縱坐標為臨界循環值。上述兩種制備方法均得到了明顯的效果，都能從中提取出質量較高的基因組DNA，并且觀察到大豆中的DNA無明顯差異。但是在熒光定量PCR中，臨界循環值具有明顯的重現性，可見其精準度與常規檢測相比要高出很多。同時，經過對靈敏度的檢測可以發現，PCR檢測中DNA的總量與檢測物基因組的大小直接影響著最終檢測靈敏度，也就是外源基因拷貝數。在特定的濃度標準品DNA進行分析定量分析時，標準曲線中無明顯的引物二聚體變化，由此可以得到轉基因大豆在定量檢測過程中的最低限值。

雖然這一檢測技術在目前已經得到了廣泛的認可，但是還有一些問題值得商榷，例如生成標準曲線的不統一，會造成實驗結果無法進行對比。又如分析靈敏度的精準性不高等，都需要研究人員想辦法加以完善。只有不斷發現該技術中存在的不足，才能更好的應用在糧油轉基因成分檢測以及其他領域的檢測活動中。