ApoJ基因修飾的BMSCs移植對腦出血大鼠C3表達的影響

劉茂春，劉 亮，普 娟，陳 慧，徐 斌，劉學良，鄭曉梅

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指原發性非外傷性腦實質出血，是急性腦血管病中的危重類型，嚴重威脅著人類的健康，且至今缺乏決定性的治療策略，目前對腦出血治療的探索仍是研究的熱點與難點[1]。研究[2]表明繼發性腦損傷是ICH后神經損傷的主要原因，而補體級聯反應在其中發揮著重要作用。近年來，細胞移植和基因療法給腦出血的治療帶來了新的希望。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是干細胞移植治療腦出血的理想細胞供體和轉基因細胞載體[3]。近來，載脂蛋白J(apolipoprotein J,ApoJ)在多種中樞神經系統疾病中的神經保護作用逐漸引起大家的重視[4]，但目前國內外關于ApoJ在腦出血方面的研究并不多。ApoJ具有確切的補體調節功能，它能否通過抑制腦出血后的補體激活發揮神經保護作用，是本研究的出發點。

本課題組前期實驗成功利用脂質體介導重組pEGFP-N1-ApoJ質粒轉染大鼠BMSCs，經免疫細胞化學法、RT-PCR和Western blot等技術證實轉染后的BMSCs能夠穩定大量表達ApoJ蛋白[5-8]；并將轉染細胞移植入大鼠腦出血部位，通過Western blot檢測發現轉染細胞能夠在ICH大鼠腦組織內表達ApoJ蛋白[9]，證實轉染后的BMSCs具有活性。在前期研究的基礎上，該實驗利用ApoJ基因修飾的BMSCs干預大鼠ICH模型，通過免疫組化和RT-PCR法檢測補體C3的表達，旨在探討ApoJ對腦出血大鼠的神經保護作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑6～8周齡SPF級雄性SD大鼠73只(1只細胞培養，72只造模)，體質量250 g左右，購自西南醫科大學實驗動物中心。α-MEM 培養基(美國HyClone公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，重組質粒pEGFP-N1-ApoJ(上海生博生物醫藥科技有限公司)，脂質體LipofectaminTM2000及TRIzol Reagent試劑盒(美國Invitrogen 公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser及SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒(北京TaKaRa 公司)，兔抗大鼠C3多克隆抗體(武漢博士德公司)，HRP標記山羊抗兔IgG(武漢阿斯本生物技術有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1BMSCs的分離和培養 頸椎脫臼處死大鼠，75%乙醇浸泡5 min，無菌分離股骨和脛骨，去兩端骨骺，用注射器吸取α-MEM培養基反復沖洗骨髓腔，沖洗液1 000 r /min 離心5 min，棄上清液，用含10%胎牛血清的新鮮α-MEM培養基重懸細胞，接種于培養瓶，于37 ℃、5% CO2飽和濕度孵育箱中培養，24 h首次半量換液，72 h全量換液，以后每3 d換液1次。每日于倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞形態及生長狀況，當細胞增殖達80%～90%融合時，按1 ∶3比例傳代培養。

1.2.2重組質粒轉染BMSCs及轉染效果的評價 將生長良好的第3代BMSCs以(4～5)×106/個接種至6孔板，待細胞70%～80%融合時，按參考文獻[6]的轉染方法，用3 μl脂質體LipofectaminTM2000介導1.6 μg重組pEGFP-N1-ApoJ質粒瞬時轉染BMSCs。轉染后24、48、72 h分別在熒光顯微鏡下觀察細胞的綠色熒光蛋白表達情況，并選擇10個熒光分布均勻的視野，計算轉染效率，轉染率=10個視野轉染陽性細胞數之和/10個視野細胞總數。收集轉染效率最高的細胞懸液，行流式分選后，調整細胞濃度為2×107個/ml備用。

1.2.3大鼠ICH模型的建立 腹腔注射3%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，俯臥位固定于腦立體定位儀上，定位右側尾狀核(以前囟為中心，向后0.2 mm，右側旁開3 mm，深6 mm)，鉆孔，斷尾取血，采用經典的“改良二次注血法”注血，第一次勻速注血20 μl(耗時2 min，留針7 min)，第二次注血30 μl(耗時4 min，留針10 min)，然后緩慢拔針，縫合切口。造模后2 h用改良神經功能評分法(modified neurological severity score，mNSS)對大鼠進行神經缺失評分，8分以上視為造模成功。

1.2.4實驗分組與細胞移植 造模后24 h，將72只ICH大鼠隨機分為3組：ApoJ/BMSCs組、BMSCs組和NS組，每組24只。3組分別移植30 μl ApoJ基因修飾的BMSCs懸液(6×105個)、BMSCs懸液(6×105個)和生理鹽水至腦出血部位(方法：再次麻醉、固定大鼠，原骨孔處垂直進針，分別在進入5、6、7 mm時各緩慢勻速推入細胞懸液10 μl，留針10 min后緩慢拔針，縫合皮膚)。各組再根據移植后再喂養時間不同，分為1、3、5、7 d 4個亞組，每亞組6只。

1.2.5組織取材 相應時間點腹腔麻醉各亞組大鼠，直接斷頭取腦，用于免疫組織化學染色的腦組織標本用4%多聚甲醛固定，然后常規脫水、透明、石蠟包埋、切片(片厚5 μm)；用于RT-PCR檢測的組織標本放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.6免疫組織化學染色 切片脫蠟至水，1 mmol/L EDTA緩沖液中微波加熱行抗原修復，3% H2O2室溫孵育10 min(以清除內源性過氧化物酶活性)，5% BSA封閉20 min，滴加一抗 (兔抗大鼠C3多克隆抗體，1 ∶150) 4 ℃過夜，加二抗 (HRP標記山羊抗兔IgG，1 ∶200)37 ℃孵育50 min，以上各步驟結束時均用PBS洗3次，每次5 min；然后加DAB溶液顯色10 min，最后蘇木精復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。在Olympus光學顯微鏡下觀察，胞質或胞核呈棕黃色者為陽性細胞，并應用 Image Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件測量C3的累積光密度值(IOD)，從而對C3蛋白的表達進行半定量分析。

1.2.7熒光實時定量PCR 取血腫周圍腦組織約100 mg，利用TRIzol試劑提取總RNA；取10 μl RNA按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進行反轉錄合成第一鏈cDNA；采用SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒進行PCR 擴增，反應體系為：2×qPCR Mix 5.0 μl、引物工作液1.0 μl、cDNA模板1.0 μl、ddH2O 2.8 μl、Rox 0.2 μl，反應條件為：預變性 95 ℃ 1 min，變性95 ℃ 15 s、退火58 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 45 s，循環40次；熔解曲線60 ℃→95 ℃，每20 s升溫1 ℃。每個樣品均作3個復孔，同時擴增GAPDH作內參。用ΔΔCT法計算補體C3 mRNA 的表達量。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司設計與合成，引物序列如表1。

表1 GAPDH、C3引物序列

2 結果

2.1BMSCs分離及形態學觀察骨髓細胞初始分離時，懸浮于培養液中，呈圓形或橢圓形，大小不一。原代培養24 h換液后可見細胞基本貼壁，呈圓形、短梭形或多角形等多種形態(圖1)。之后3～5 d圓形細胞明顯減少，梭形細胞為主，呈放射狀排列的細胞集落并互相融合。第6天梭形細胞集落增多，細胞融合達90%以上，呈旋渦狀排列(圖2)。經多次換液和傳代，細胞不斷純化，傳至第3代時，可得到純度高、形態均一、生長良好的BMSCs(圖3)。

2.2轉染后熒光觀察及轉染效率的測定轉染后隨時間的延長，表達綠色熒光蛋白的陽性細胞逐漸增多，72 h時綠色熒光表達最強(圖3、4)，轉染效率最高，約36%左右。

2.3免疫組化結果各組各時間點腦出血灶周邊區都可見補體C3蛋白表達，C3主要表達于神經元、神經膠質細胞、血管內皮細胞及中性粒細胞的胞質。ApoJ/BMSCs組和BMSCs組在1、3、5、7 d隨時間的延長，C3蛋白的表達逐漸降低，其中ApoJ/BMSCs組各時間點C3蛋白的表達低于同時間點BMSCs組和NS組，BMSCs組又低于同時間點NS組，差異均有統計學意義(P<0.05)(表2、圖5)。

表2 各組不同時間點C3蛋白的表達變化

與BMSCs組比較：*P<0.05；與NS組比較：#P<0.05

圖1 BMSCs原代培養第1天 ×200 圖2 BMSCs原代培養第6天 ×40 圖3 第3代BMSCs ×100 圖4 第3代BMSCs轉染72 h ×100

圖5 C3在各組腦組織中的表達情況 ×200A：ApoJ/BMSCs組；B：BMSCs組；C：NS組；1：1 d；2：3 d；3：5 d；4：7 d

表3 各組補體C3的mRNA表達

與BMSCs組比較：*P<0.05；與NS組比較：#P<0.05

2.4PCR結果隨時間的延長，ApoJ/BMSCs組和BMSCs組補體 C3 mRNA 的表達逐漸降低，其中ApoJ/BMSCs組各時間點C3 mRNA的表達明顯低于同時間點BMSCs組和NS組，BMSCs組又低于同時間點NS組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3、圖6。各組補體C3和內參GAPDH的mRNA 表達擴增圖譜，見圖7。

圖6 各組補體C3 mRNA 的相對表達水平A：ApoJ/BMSCs組；B：BMSCs組；C：NS組；1：1 d；2：3 d；3：5 d；4：7 d；與NS組比較：*P<0.001; 與BMSCs組比較：#P<0.001

3 討論

載脂蛋白J是一種廣泛存在于各種組織和體液中的多功能糖蛋白，具有眾多生物學功能，主要包括：轉運脂質、抗動脈粥樣硬化、調節補體、抑制氧化應激、抗凋亡、保護細胞膜、促進損傷組織修復及調節生殖等[10]。ApoJ作為一種非典型熱休克蛋白，腦損傷后其表達的上調是一種機體內源性應激保護反應[11]。但具體的神經保護作用機制目前尚未完全明確，有學者認為可能與其補體調節功能有關。前期鄭曉梅 等[12]研究發現ApoJ對腦出血大鼠的內源性保護作用可能是通過抑制補體激活而實現的。

補體C3是補體系統發揮作用的核心，可作為補體活化的指標。補體系統通過3條激活途徑產生補體受體1的配體(C3b)[13]，最終形成膜攻擊復合物(membrane attack complex，MAC)C5b-9，MAC損傷胞膜導致靶細胞溶解死亡[14]。腦出血后補體激活誘導細胞膜攻擊，導致炎癥反應、細胞凋亡、血腦屏障破壞和腦水腫[15-16]。研究[17]顯示應用補體抑制劑治療腦出血效果顯著，而ApoJ作為確切的補體抑制因子，可能成為腦出血新的治療措施。

圖7 補體C3和內參GAPDH的mRNA 表達擴增圖譜A:補體C3; B:內參GAPDH

本研究旨在探討ApoJ對腦出血大鼠的神經保護作用機制。前期研究已經證實外源性ApoJ能夠成功轉染BMSCs，且攜帶ApoJ基因的BMSCs能夠在ICH大鼠腦組織內表達ApoJ蛋白，本實驗的轉染結果與文獻[5-8]結果一致，證實轉染成功。本實驗利用外源性ApoJ干預大鼠ICH模型，通過免疫組化和RT-PCR法分別檢測C3蛋白和mRNA的表達變化。結果顯示，ApoJ/BMSCs組和BMSCs組的C3表達隨時間的延長逐漸降低，其中ApoJ/BMSCs組又顯著低于同時間點BMSCs組。表明ApoJ/BMSCs組和BMSCs組均能下調C3的表達，但ApoJ/BMSCs組下降更為顯著，從而推測ApoJ基因修飾的BMSCs較單純BMSCs更能抑制腦出血后的補體級聯反應。其實早在1989年Jenne et al[18]便已發現ApoJ可通過結合補體C5b-7而終止補體級聯反應。2016年Huang et al[4]通過側腦室注入人重組ApoJ蛋白干預腦損傷大鼠模型，發現ApoJ可通過抑制腦損傷后補體激活和氧化應激反應，減輕炎癥反應、保護血腦屏障和減輕腦水腫，促進大鼠神經功能恢復，本實驗結果與之相符。

本研究證實了ApoJ對腦出血大鼠的神經保護作用是通過抑制補體激活機制而實現的，是否還有其他機制的參與需要進一步深入研究，這為進一步研究ApoJ對腦出血的治療作用提供了新的理論依據。