評價多種抗原在非典型脊柱結核輔助診斷中的作用

吳仁森，孟曉源，李 坤,，車立新，郭 瑞

全世界大約有三分之一的人為潛伏性結核感染者，約有10%的潛伏性結核感染者會發展成活動性結核患者[1]。結核桿菌最常侵犯的是肺組織，其次是骨與關節，約占肺外結核10%左右。在骨與關節結核中，脊柱結核約占50%左右[2]。由于脊柱結核病灶較深，發病不典型，目前仍沒有足夠的證據及指南來指導脊柱結核的早期診斷[3]。臨床上，有些脊柱結核患者癥狀不典型，影像學上表現也難以和普通脊柱炎性病變及腫瘤相鑒別，這類脊柱結核被定義為非典型脊柱結核。關于非典型脊柱結核的文獻報道較少，多以個案報道的形式出現[4]，因為臨床少見，癥狀及輔助檢查不典型，所以常常耽誤了患者治療的最佳時機。血清抗原在結核病輔助診斷方面一直備受研究人員關注，尤其在早期快速診斷方面[5]。熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsps)作為抗原物質，既可以引起細胞免疫也可以引起體液免疫[6]。該文選取結核桿菌熱休克蛋白10(Mycobacteriumtuberculosisheat shock protein 10，MTB Hsp 10)、結核桿菌熱休克蛋白60(Mycobacteriumtuberculosisheat shock protein 60，MTB Hsp 60)、熱休克蛋白16.3(heat shock protein 16.3，Hsp 16.3)和熱休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp 70)4種抗原，通過ELISA技術來評估其在非典型脊柱結核輔助診斷上的價值。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2016年2月～2017年3月新疆自治區人民醫院脊柱外科收治的疑似非典型脊柱結核患者66例。所有患者行術前穿刺或術后病理檢查，或行病灶病原菌培養檢查。最終確診為非典型脊柱結核37例，其中男20例，女17例；年齡16～70(40.8±11.2)歲；脊柱其他疾病26例，其中男14例，女12例；年齡24～57(43.5±10.4)歲；診斷未明確及隨訪丟失共3例(排除試驗)。以上分組由同一主治醫師按照一定納入、排除標準完成。另外選取30例健康體檢者做空白對照組，其中男18例，女12例；年齡20～57(39.6±11.3)歲。非典型脊柱結核組納入標準：① 單節段椎骨結核；② 脊柱附件結核；③ 多節段椎骨結核；④ 無明顯骨質破壞，但伴有冷膿腫形成；⑤ 無明顯骨質破壞，但病理檢查有結核性肉芽腫；⑥ 術前或術后病理檢查符合結核改變；⑦ 入院前未經抗結核治療，入院后經正規抗結核治療后，患者癥狀好轉或治愈；⑧ 排除合并HIV感染患者；⑨ 全部患者隨訪≥6個月。脊柱其他疾病組納入標準：① 排除脊柱結核可能；② 既往無結核病病史，無結核病家族史、接觸史；③ 排除合并HIV感染患者。本研究經過醫院倫理委員會批準，所有受試人員簽署知情同意書。

1.2試劑結核桿菌熱休克蛋白(MTB Hsp 10、MTB Hsp 60)和熱休克蛋白(Hsp 70、Hsp 16.3)ELISA檢測試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司生產提供。

1.3方法自行設計信息采集表對入選受試人員進行信息采集，包括入選人員人口學基本信息，患者臨床特征，入院后患者的實驗室檢驗結果。收集受試者靜脈血5 ml，室溫下靜置20 min，3 000 r/min離心20 min，取上清液于-80 ℃冷藏待測。

采用ELISA技術檢測血清中熱休克蛋白。在酶標包被板上加入標準品，并稀釋成不同濃度梯度來設置標準濃度。分別在酶標包被板剩余孔里加樣品稀釋液和待測血清樣本，在37 ℃溫箱中溫育30 min后用自動洗板機沖洗5次，拍干后加酶標試劑再次溫育、洗滌、拍干。在酶標包被板各孔中分別加入顯色劑A、顯色劑B，混勻后放入37 ℃恒溫箱內避光顯色15 min。顯色結束后在酶標包被板各孔內加入終止液終止反應。用酶標儀以空白孔調零，在450 nm波長下讀取各孔吸光度(optical density，OD)值并做記錄。

2 結果

2.1入選試驗對象臨床特征及臨床檢驗結果試驗入選了66例疑似非典型脊柱結核患者，隨訪6～12個月，其中1例最終未明確診斷，2例隨訪丟失，最終有63例患者完成試驗。經最終確診非典型脊柱結核37例，有32例患者接受手術治療，5例保守治療，所有患者接受正規抗結核治療10～12個月；26例其他脊柱疾病患者中，包括脊柱轉移瘤11例，化膿性脊柱炎7例，脊柱原發腫瘤4例，布氏桿菌病4例；30例健康體檢者無家族結核病史，無結核病接觸史。所有入選對象均接受臨床特征信息采集及臨床相關檢驗。見表1。

2.2非典型脊柱結核組患者影像學特征本組37例患者均接受X線攝片和CT或者MRI檢查。主要的影像學特征有：① X線片表現為骨質增生、骨贅形成，椎間隙變窄；② MRI可見椎體軟骨終板破壞，呈蟲蝕樣變化；③ 單一椎體中心病變，或者單一椎體壓縮性病變；④ 單側椎弓根破壞或者棘突破壞，可累計多個部位；⑤ 影像學表現與癥狀不符，影像學表現較重，但患者癥狀表現不明顯。

2.34種抗原血清ELISA檢測結果93例受試者均接受4種抗原血清ELISA測定，結果以酶標儀在450 nm波長下讀取各孔OD值體現。非典型脊柱結核組、脊柱其他疾病組和健康體檢組血清中的4種抗原OD值不全相等(P<0.001)(表2)。非典型脊柱結核組血清4種抗原OD值要比脊柱其他疾病組和健康體檢組高(P<0.05)，而脊柱其他疾病組和健康體檢組之間4種抗原OD值差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 93例入選試驗對象臨床特征信息及臨床檢驗結果

表2 4種抗原ELISA血清學檢測結果(OD450 nm值

與非典型脊柱結核組比較：*P<0.05

表3 4種抗原及聯合診斷AUC、95% CI和約登指數

2.44種抗原及聯合診斷對非典型脊柱結核的診斷價值根據4種抗原的OD值繪制四種抗原及聯合診斷的ROC曲線(圖1)，根據ROC曲線計算4種抗原及聯合診斷AUC、95%置信區間(confidence interval，CI)和約登指數(表3)。MTB Hsp 10診斷靈敏度和特異度分別是87%、73%，MTB Hsp 60是89%、75%，Hsp 16.3是70%、84%，Hsp 70是51%、91%，4種抗原聯合診斷靈敏度和特異度是89%、98%。

圖1 MTB Hsp 10、MTB Hsp 60、Hsp 70和Hsp 16.3四種抗原及聯合診斷的ROC曲線

3 討論

在脊柱結核的早期，脊柱“僵”是一個重要陽性體征[7]。本試驗納入的37例非典型脊柱結核中，有31例出現腰背部肌肉僵硬、鈍痛、叩擊疼等不適癥狀。但這些癥狀不是脊柱結核特有體征，包括低熱、盜汗、納差、消瘦等癥狀在脊柱化膿性病變和脊柱腫瘤也有發現。影像學檢查是脊柱結核診斷中不可或缺的方法，但在脊柱結核診斷中X線片的診斷價值有限，尤其在部分非典型脊柱結核患者X線片上僅表現為骨質增生。CT和MRI在脊柱結核早期診斷中具有一定價值，可發現骨質的細微變化，尤其是MRI在脊柱結核早期診斷上具有很高的敏感性。但最終確診仍需病灶組織切片或者細菌培養。紅細胞沉降率、C-反應蛋白和白細胞計數在感染活動期對結核診斷有一定指導意義，本研究顯示非典型脊柱結核組與脊柱其他疾病組比較，紅細胞沉降率、CRP等炎性指標較高，但是紅細胞沉降率、C-反應蛋白主要反應炎性反應，診斷結核病特異性差。

由于非典型脊柱結核所表現出的癥狀不典型，往往更容易被誤診，從而延誤治療的最佳時機。如果非典型脊柱結核早期被診斷并參照一般脊柱結核的治療原則，將會達到和一般脊柱結核相同的治療效果。所以尋找一種快速、經濟、準確的診斷方法非常重要。近年來對結核桿菌抗原上的研究催生了很多對結核疾病新的診斷方法。Hsps是具有調控蛋白降解、耐熱、免疫調節等功能的一類抗原蛋白[8]。人在結核桿菌感染過程中，Hsps誘導免疫反應，激活Toll樣受體的作用[9]。研究人員利用Hsps這些特性來研究其對結核病診斷作用。

本研究通過ELISA技術檢測人血清中兩種結核桿菌熱休克蛋白(MTB Hsp 10、MTB Hsp 60)和兩種宿主熱休克蛋白(Hsp 16.3、Hsp 70)在450 nm處OD值顯示，非典型脊柱結核患者血清中4種抗原OD值明顯高于脊柱其他疾病和健康人。Shekhawat et al[10]通過檢測結核患者腦脊液和血清發現，與對照組對比多種熱休克蛋白均增高。這種變化反映了宿主對結核桿菌感染的免疫應答，同時也反映了結核桿菌自身對宿主免疫對抗作用[10]。

通過繪制四種抗原的ROC曲線，計算AUC、約登指數、靈敏度和特異度發現，MTB Hsp 60的診斷效率最高，雖然MTB Hsp 10和MTB Hsp 60診斷靈敏度較高，但是Hsp 16.3和Hsp 70的診斷特異性較高。聯合4種抗原繪制ROC曲線，計算AUC=0.97，靈敏度和特異度分別為89%和98%，可以認為聯合4種抗原對非典型脊柱結核診斷效率要高于任意一種單獨抗原。

本研究也有許多不足之處，如納入樣本量較少，結核患者均為成年人，沒有納入兒童非典型脊柱結核患者，Hsps在兒童脊柱結核血清中表達尚不清楚等。總之，運用ELISA技術測定非典型脊柱結核患者血清中特異性抗原的含量是一種簡單、快速、廉價的結核診斷方法，MTB Hsp10、MTB Hsp60、Hsp16.3和Hsp70 4種抗原在非典型脊柱結核輔助診斷中具有一定價值。