BDNF在慢性不可預見性溫和刺激應激大鼠海馬星形膠質細胞中的表達

吳紅芳，金齊穎，曹金英，馬原源，張園園，劉 昊

抑郁癥雖然發病機制未明，但可以肯定的是長期慢性應激可以促進抑郁癥的發生，嚴重威脅人類健康[1]。近年來關于抑郁癥發病機制的研究主要集中在非單胺類神經遞質的假說，如細胞因子、谷氨酸及其受體、腦源性神經營養因子假說、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)亢進假說等。星形膠質細胞在維持神經系統內環境穩定中起到至關重要的作用，其結構和功能異常可能與抑郁癥發病存在聯系。腦源性神經營養因子(brain-derived neurophic factor，BDNF)是神經元細胞存活及再生的關鍵因子之一[2]。動物實驗研究[3-4]表明，BDNF表達異常與抑郁癥有關。目前國內外抑郁癥發病機制方面多集中于對海馬神經元細胞的研究，對于海馬部位星形膠質細胞的研究少有報道。該研究建立大鼠抑郁癥模型，觀察大鼠海馬星形膠質細胞BDNF表達情況，以期對抑郁癥的發病機制研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1動物及試劑① 實驗動物：成年清潔級(SPF)SD大鼠(雄性，體質量160～220 g)60只，(華北理工大學動物飼養實驗中心提供)，實驗前先給予7 d常規適應性飼養。飼養條件：室溫恒定(22～25 ℃)，每籠飼養3～5只，晝夜節律(12 h/12 h)，自由獲取食物和自來水。② 主要試劑：兔抗BDNF多克隆抗體購自上海Protein Tech公司；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；免疫印跡相關試劑購自武漢博士德生物工程有限公司；羊抗膠質纖維酸性蛋白(glial fabrilary acidic protein,GFAP)抗體、羊抗兔lgG/Alexa Fluor488、羊抗鼠lgG/Alexa Fluor647均購自北京博奧森生物技術有限公司；石蠟切片機(HZ1220)、激光共聚焦顯微鏡(TCSSP8 STED)購自德國徠卡公司。

1.2實驗大鼠的處理采用隨機數字表法，將大鼠分為兩組：① 對照組：共30只，不做特殊處理；② 應激組：共30只，給予慢性不可預見性溫和刺激(chronic unpredictable mild stimulation，CUMS)處理。應激如下：鼠籠搖晃15 min；行為束縛24 h；鼠籠45°傾斜24 h；4 ℃的冰水游泳5 min；42 ℃的熱水游泳5 min；禁水24 h；禁食24 h；雙耳電擊5 s兩次(0.8 mA)；夾鼠尾60 s；潮濕墊料24 h；黑白顛倒(如持續光照24 h或持續黑暗24 h)。每天隨機選取1種刺激方法，但確保同種刺激不連續使用，共進行28 d。對照組無特殊處理，除每天抓取1次。應激結束后第1 、7、14天處死應激組和對照組大鼠。

1.3行為學檢測① 糖水偏好實驗：實驗前先讓大鼠禁水禁食1 d，把兩個完全相同水瓶放置在每個鼠籠內，200 ml 1%的糖水和200 ml的純凈水分別灌入兩水瓶內，雙瓶供飲，確保水瓶完好無滴漏，測量糖水和純凈水的消耗量(60 min內)，計算大鼠的糖水偏好率，糖水偏好率(%)=糖水消耗量(ml)/總液體消耗量(ml)×100%。② 曠場實驗：造模成功后，每天同一時間段內將1只大鼠放入曠場中心方格(規格：長120 cm，寬120 cm，高35 cm)內，使用鼠博士視頻分析儀進行記錄，主要包括：行走總路程、中央活動時間、豎立次數和修飾次數。③ Morris水迷宮實驗：連續3 d大鼠在1 min內找到水下平臺的時間，并利用相關儀器記錄，即逃避潛伏期，每天6個循環。根據3 d的測試結果計算空間記憶成績。

1.4免疫熒光雙標① 標本制備：將各組大鼠麻醉后行多聚甲醛灌流固定，冰凍切片，片厚度為15 μm。② 免疫熒光雙標染色：將冰凍切片從-80 ℃冰箱取出，室溫放置30 min，按免疫組化學步驟進行免疫熒光雙標染色，一抗混合液(兔抗BDNF多克隆抗體和羊抗GFAP混合液)使用濃度1 ∶100，陰性對照用PBS代替一抗，Alexa Fluor488標記的羊抗兔和Alexa Fluor647標記的羊抗鼠熒光二抗混合液使用濃度1 ∶200，DAPI復染核，封片劑封片并置于避光盒內，最后通過激光共聚焦顯微鏡觀察并應用計算機進行數據采集和成像。

1.5Westernblot檢測大鼠海馬BDNF的蛋白表達大鼠完全麻醉后，斷頭取腦，在冰上剝離海馬，提取組織總蛋白。用BCA蛋白試劑盒測定上清液中的蛋白質濃度，根據BCA法測定的蛋白上樣量(30 μg)上樣，之后12% SDS-PAGE電泳，再之PVDF膜電轉，封閉2 h(5%BSA)，相應一抗兔抗BDNF多克隆抗體(1 ∶400)置于4 ℃的冰箱內孵育過夜，相應的二抗羊抗兔IgG(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，ECL顯色。內參β-actin應用同樣的步驟操作并進行分析。計算目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1糖水偏好實驗結果在普通水消耗量上，應激組與對照組比較差別無意義(P>0.05)；但在糖水消耗量及糖水偏好率上，兩組間差異均有統計學意義(P<0.01)，而且應激組較對照組均偏低，見表1。

2.2曠場實驗和Morris水迷宮實驗應激組與對照組相比，大鼠的行走總路程、中央活動時間、豎立次數、修飾次數、平均逃避潛伏期差異均有統計學意義(P<0.01)，其中，與對照組比較，應激組的行走總路程、中央活動時間、豎立次數、修飾次數均降低，而平均逃避潛伏期較對照組明顯延長，見圖1、表2。

2.3GFAP和BDNF免疫熒光雙標結果GFAP為綠色熒光，BDNF為紅色熒光，GFAP和BDNF兩種蛋白熒光Merge之后呈現黃色(見圖2A4、B4)，表明部分星形膠質細胞的胞質內GFAP和BDNF同時表達，說明GFAP和BDNF有部分共定位。兩者比較，應激組(CUMS后1 d)GFAP-BDNF雙重染色的細胞數及BDNF均較對照組明顯減少。見圖2。

表1 兩組大鼠糖水偏好實驗結果

圖1 兩組大鼠曠場實驗和水迷宮實驗軌跡圖A：曠場實驗；B：水迷宮實驗；1：對照組；2：應激組

表2 兩組大鼠曠場實驗和水迷宮實驗結果

圖2 GFAP和BDNF免疫熒光雙標結果 ×400A：對照組；B：應激組(CUMS后1 d)；1：GFAP細胞數；2：BDNF細胞數；3：細胞核；4：GFAP-BDNF雙重染色細胞數

2.4各組大鼠海馬組織中BDNF蛋白表達水平對照組、應激組大鼠應激刺激結束后1、7、14 d，海馬組織中BDNF的蛋白表達水平分別為(0.795±0.023)、(0.313±0.017)、(0.631±0.013)、(0.719±0.037)，差異有統計學意義(F=761.304，P<0.001)。應激組蛋白表達水平雖逐漸增高，但均低于對照組(P<0.01)，見圖3。

圖3各組大鼠海馬組織中BDNF蛋白表達水平1：對照組；2～4：應激組(CUMS后1、7、14 d)

3 討論

本實驗行為學檢測結果表明，CUMS后大鼠表現出快感缺失，運動能力、探索行為、視空間和記憶力的減退等癥狀[5]，說明給予大鼠CUMS能較好地反映抑郁癥的主要癥狀。

BDNF對維持神經元的分化、存活及可塑性具有重要作用，與抑郁癥和焦慮有關[6]。研究[7-8]顯示，抑郁癥的發生和嚴重程度與BDNF蛋白的異常表達存在聯系，但研究結果不一[9-11]。本研究結果表明，CUMS后1、7、14 d大鼠海馬組織中BDNF的表達呈現逐漸增高的趨勢，但均較對照組偏低。推測應激刺激后BDNF的表達并不是單一的下降或升高，而是存在一個動態的變化過程。

星形膠質細胞是神經系統功能活動中不可或缺的重要組成部分，但在抑郁癥的發病過程中，關于星形膠質細胞的功能和作用，目前的研究相對較少。利用熒光標記法顯示星形膠質細胞特異性標記蛋白GFAP，可以在原位顯示星形膠質細胞[12]。本實驗中，采用免疫熒光雙標方法檢測GFAP和BDNF的表達，結果顯示給予CUMS應激后，大鼠海馬部分星形膠質細胞胞質內GFAP和BDNF存在共定位，說明星形膠質細胞中有BDNF的合成。同時，本實驗的Western blot結果表明CUMS后大鼠1、7、14 d海馬組織中BDNF的蛋白表達均低于對照組，這種降低有可能由星形膠質細胞合成分泌BDNF降低引起。但本實驗未對星形膠質細胞進行單獨檢測和分析，因此，給予CUMS應激導致的海馬組織BDNF降低，在多大程度上由星形膠質細胞合成BDNF的變化而引起，就本實驗結果看目前還不能確定。本研究結果提示給予大鼠CUMS后，海馬星形膠質細胞BDNF出現改變，有必要進行深入研究。