BDNF在慢性不可預(yù)見性溫和刺激應(yīng)激大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

吳紅芳，金齊穎，曹金英，馬原源，張園園，劉 昊

抑郁癥雖然發(fā)病機(jī)制未明，但可以肯定的是長期慢性應(yīng)激可以促進(jìn)抑郁癥的發(fā)生，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。近年來關(guān)于抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在非單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的假說，如細(xì)胞因子、谷氨酸及其受體、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子假說、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)亢進(jìn)假說等。星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起到至關(guān)重要的作用，其結(jié)構(gòu)和功能異常可能與抑郁癥發(fā)病存在聯(lián)系。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurophic factor，BDNF)是神經(jīng)元細(xì)胞存活及再生的關(guān)鍵因子之一[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[3-4]表明，BDNF表達(dá)異常與抑郁癥有關(guān)。目前國內(nèi)外抑郁癥發(fā)病機(jī)制方面多集中于對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的研究，對(duì)于海馬部位星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究少有報(bào)道。該研究建立大鼠抑郁癥模型，觀察大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF表達(dá)情況，以期對(duì)抑郁癥的發(fā)病機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及試劑① 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年清潔級(jí)(SPF)SD大鼠(雄性，體質(zhì)量160～220 g)60只，(華北理工大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中心提供)，實(shí)驗(yàn)前先給予7 d常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：室溫恒定(22～25 ℃)，每籠飼養(yǎng)3～5只，晝夜節(jié)律(12 h/12 h)，自由獲取食物和自來水。② 主要試劑：兔抗BDNF多克隆抗體購自上海Protein Tech公司；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；免疫印跡相關(guān)試劑購自武漢博士德生物工程有限公司；羊抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fabrilary acidic protein,GFAP)抗體、羊抗兔lgG/Alexa Fluor488、羊抗鼠lgG/Alexa Fluor647均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；石蠟切片機(jī)(HZ1220)、激光共聚焦顯微鏡(TCSSP8 STED)購自德國徠卡公司。

1.2實(shí)驗(yàn)大鼠的處理采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為兩組：① 對(duì)照組：共30只，不做特殊處理；② 應(yīng)激組：共30只，給予慢性不可預(yù)見性溫和刺激(chronic unpredictable mild stimulation，CUMS)處理。應(yīng)激如下：鼠籠搖晃15 min；行為束縛24 h；鼠籠45°傾斜24 h；4 ℃的冰水游泳5 min；42 ℃的熱水游泳5 min；禁水24 h；禁食24 h；雙耳電擊5 s兩次(0.8 mA)；夾鼠尾60 s；潮濕墊料24 h；黑白顛倒(如持續(xù)光照24 h或持續(xù)黑暗24 h)。每天隨機(jī)選取1種刺激方法，但確保同種刺激不連續(xù)使用，共進(jìn)行28 d。對(duì)照組無特殊處理，除每天抓取1次。應(yīng)激結(jié)束后第1 、7、14天處死應(yīng)激組和對(duì)照組大鼠。

1.3行為學(xué)檢測① 糖水偏好實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前先讓大鼠禁水禁食1 d，把兩個(gè)完全相同水瓶放置在每個(gè)鼠籠內(nèi)，200 ml 1%的糖水和200 ml的純凈水分別灌入兩水瓶內(nèi)，雙瓶供飲，確保水瓶完好無滴漏，測量糖水和純凈水的消耗量(60 min內(nèi))，計(jì)算大鼠的糖水偏好率，糖水偏好率(%)=糖水消耗量(ml)/總液體消耗量(ml)×100%。② 曠場實(shí)驗(yàn)：造模成功后，每天同一時(shí)間段內(nèi)將1只大鼠放入曠場中心方格(規(guī)格：長120 cm，寬120 cm，高35 cm)內(nèi)，使用鼠博士視頻分析儀進(jìn)行記錄，主要包括：行走總路程、中央活動(dòng)時(shí)間、豎立次數(shù)和修飾次數(shù)。③ Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：連續(xù)3 d大鼠在1 min內(nèi)找到水下平臺(tái)的時(shí)間，并利用相關(guān)儀器記錄，即逃避潛伏期，每天6個(gè)循環(huán)。根據(jù)3 d的測試結(jié)果計(jì)算空間記憶成績。

1.4免疫熒光雙標(biāo)① 標(biāo)本制備：將各組大鼠麻醉后行多聚甲醛灌流固定，冰凍切片，片厚度為15 μm。② 免疫熒光雙標(biāo)染色：將冰凍切片從-80 ℃冰箱取出，室溫放置30 min，按免疫組化學(xué)步驟進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色，一抗混合液(兔抗BDNF多克隆抗體和羊抗GFAP混合液)使用濃度1 ∶100，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，Alexa Fluor488標(biāo)記的羊抗兔和Alexa Fluor647標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗混合液使用濃度1 ∶200，DAPI復(fù)染核，封片劑封片并置于避光盒內(nèi)，最后通過激光共聚焦顯微鏡觀察并應(yīng)用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和成像。

1.5Westernblot檢測大鼠海馬BDNF的蛋白表達(dá)大鼠完全麻醉后，斷頭取腦，在冰上剝離海馬，提取組織總蛋白。用BCA蛋白試劑盒測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)BCA法測定的蛋白上樣量(30 μg)上樣，之后12% SDS-PAGE電泳，再之PVDF膜電轉(zhuǎn)，封閉2 h(5%BSA)，相應(yīng)一抗兔抗BDNF多克隆抗體(1 ∶400)置于4 ℃的冰箱內(nèi)孵育過夜，相應(yīng)的二抗羊抗兔IgG(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，ECL顯色。內(nèi)參β-actin應(yīng)用同樣的步驟操作并進(jìn)行分析。計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果在普通水消耗量上，應(yīng)激組與對(duì)照組比較差別無意義(P>0.05)；但在糖水消耗量及糖水偏好率上，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而且應(yīng)激組較對(duì)照組均偏低，見表1。

2.2曠場實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)應(yīng)激組與對(duì)照組相比，大鼠的行走總路程、中央活動(dòng)時(shí)間、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)、平均逃避潛伏期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中，與對(duì)照組比較，應(yīng)激組的行走總路程、中央活動(dòng)時(shí)間、豎立次數(shù)、修飾次數(shù)均降低，而平均逃避潛伏期較對(duì)照組明顯延長，見圖1、表2。

2.3GFAP和BDNF免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果GFAP為綠色熒光，BDNF為紅色熒光，GFAP和BDNF兩種蛋白熒光Merge之后呈現(xiàn)黃色(見圖2A4、B4)，表明部分星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)GFAP和BDNF同時(shí)表達(dá)，說明GFAP和BDNF有部分共定位。兩者比較，應(yīng)激組(CUMS后1 d)GFAP-BDNF雙重染色的細(xì)胞數(shù)及BDNF均較對(duì)照組明顯減少。見圖2。

表1 兩組大鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 兩組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)軌跡圖A：曠場實(shí)驗(yàn)；B：水迷宮實(shí)驗(yàn)；1：對(duì)照組；2：應(yīng)激組

表2 兩組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 GFAP和BDNF免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果 ×400A：對(duì)照組；B：應(yīng)激組(CUMS后1 d)；1：GFAP細(xì)胞數(shù)；2：BDNF細(xì)胞數(shù)；3：細(xì)胞核；4：GFAP-BDNF雙重染色細(xì)胞數(shù)

2.4各組大鼠海馬組織中BDNF蛋白表達(dá)水平對(duì)照組、應(yīng)激組大鼠應(yīng)激刺激結(jié)束后1、7、14 d，海馬組織中BDNF的蛋白表達(dá)水平分別為(0.795±0.023)、(0.313±0.017)、(0.631±0.013)、(0.719±0.037)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=761.304，P<0.001)。應(yīng)激組蛋白表達(dá)水平雖逐漸增高，但均低于對(duì)照組(P<0.01)，見圖3。

圖3各組大鼠海馬組織中BDNF蛋白表達(dá)水平1：對(duì)照組；2～4：應(yīng)激組(CUMS后1、7、14 d)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)行為學(xué)檢測結(jié)果表明，CUMS后大鼠表現(xiàn)出快感缺失，運(yùn)動(dòng)能力、探索行為、視空間和記憶力的減退等癥狀[5]，說明給予大鼠CUMS能較好地反映抑郁癥的主要癥狀。

BDNF對(duì)維持神經(jīng)元的分化、存活及可塑性具有重要作用，與抑郁癥和焦慮有關(guān)[6]。研究[7-8]顯示，抑郁癥的發(fā)生和嚴(yán)重程度與BDNF蛋白的異常表達(dá)存在聯(lián)系，但研究結(jié)果不一[9-11]。本研究結(jié)果表明，CUMS后1、7、14 d大鼠海馬組織中BDNF的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，但均較對(duì)照組偏低。推測應(yīng)激刺激后BDNF的表達(dá)并不是單一的下降或升高，而是存在一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)功能活動(dòng)中不可或缺的重要組成部分，但在抑郁癥的發(fā)病過程中，關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能和作用，目前的研究相對(duì)較少。利用熒光標(biāo)記法顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白GFAP，可以在原位顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞[12]。本實(shí)驗(yàn)中，采用免疫熒光雙標(biāo)方法檢測GFAP和BDNF的表達(dá)，結(jié)果顯示給予CUMS應(yīng)激后，大鼠海馬部分星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)GFAP和BDNF存在共定位，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞中有BDNF的合成。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的Western blot結(jié)果表明CUMS后大鼠1、7、14 d海馬組織中BDNF的蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，這種降低有可能由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成分泌BDNF降低引起。但本實(shí)驗(yàn)未對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)檢測和分析，因此，給予CUMS應(yīng)激導(dǎo)致的海馬組織BDNF降低，在多大程度上由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成BDNF的變化而引起，就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看目前還不能確定。本研究結(jié)果提示給予大鼠CUMS后，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF出現(xiàn)改變，有必要進(jìn)行深入研究。