過表達IDO骨髓間充質干細胞分泌外泌體改善移植心臟存活

賀繼剛，韓金秀，撒亞蓮，嚴 丹，李貝貝

隨著醫學科技進步，抗免疫排異藥物不斷更新，免疫基礎、臨床研究的進展，器官移植已成為終末器官衰竭治療的手段之一。目前抑制免疫排異反應主要有兩種方法：① 藥物抑制，包括嗎替麥考等；② 生物抑制法。目前認為骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)可以抑制器官排異反應[1]。但因為BMSCs的安全性一直以來未得到有效證實，其臨床應用受到限制。吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO) 可在胎盤和淋巴組織中廣泛表達，是除肝臟外唯一能催化色氨酸循犬尿酸分解途徑代謝的催化限速酶，在哺乳動物組織與細胞，尤其是胎盤和淋巴組織中廣泛表達。它能夠催化降解色氨酸有效促進移植物存活[2]。課題組前期已經證實過表達IDO-BMSCs可以有效抑制免疫排異反應[3]。外泌體(exosome)是直徑介于50～100 nm的囊泡，其是以出芽方式從細胞上產生的鱗片狀囊泡，它擁有多項生物功能，能使細胞在不必直接作用下實現細胞與細胞遠距離生物信息傳導，目前其已成為研究熱點[4]。該研究通過提取過表達IDO-BMSCs分泌的exosome試圖證明外泌體在抑制免疫排異反應中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康4周齡SPF級Wistar及SD成年雄性大鼠各70只，購自成都達碩科技實驗動物。

1.2主要試劑和儀器大鼠液相芯片試劑盒TGFBMAG-64K-03及RECYTMAG-65K-07(美國密理博公司)；流式細胞儀BD Accuri C6 (美國BD公司)；小動物活體成像儀(美國冷泉港公司)；心臟彩超EPIQ 7C(荷蘭飛利浦公司)；抗OX62大鼠色疫磁珠(德國美天旎公司)。其它試劑見文獻[3]。

1.3方法

1.3.1大鼠BMSCs培養及鑒定 全骨髓培養，胰酶消化傳代至第7代。取生長至P7代BMSCs，并檢測細胞黏附分子29(CD29)、細胞歸巢因子-44(CD44)、CD90、CD73、CD45、CD11b、造血干祖細胞表面抗原(CD34)。

1.3.2過表達IDO-BMSCs構建 利用慢病毒GV308構建IDO載體并使用強力霉素作為基因開啟劑實現大鼠BMSCs過表達IDO，分兩組：陰性對照組(NC組)，過表達IDO組(OE組)，每組包含3組細胞。而后根據文獻[4]采用定量PCR方法檢測轉染2 d后IDO基因表達量。

1.3.3建立腹腔異位心臟移植模型 根據文獻[5]建立腹腔異位心臟移植模型。并采用心臟彩超EPIQ 7C評估建模3 d后移植心臟射血分數(ejection fraction,EF)、短軸縮短率(fractional shortening,FS)改變。

1.3.4Exosome提取及檢測 按照SBI公司ExoQuick-TC說明書提取exosome并利用電鏡檢測分泌出的exosome形態[6]。

1.3.5心臟彩超評估移植心臟心功能和小動物活體成像評估心臟熒光強度 提取各組細胞分泌的exosome。經Dir預染后。經尾靜脈注射到腹腔異位移植心臟術后3 d的大鼠模型中。共分為過表達IDO-BMSCs-exosome組、空載體-BMSCs-exosome組、BMSCs-exosome組，每組3只大鼠，每只大鼠經由尾靜脈注射400 μl(800 mg/ml)的exosome，將嗎替麥考組(給予嗎替麥考喂養2 d)及未處理組做為對照組，每組3只大鼠。并采用二維心臟超聲評估移植心臟心功能和采用小動物活體成像評估移植心臟熒光強度。

1.3.6受體大鼠脾臟細胞表面抗原分子表達檢測 取受體大鼠完整脾臟組織，制備脾臟單細胞懸液。按Miltenyi公司的Anti-DC(OX62) Microbeads rat試劑盒說明書操作陽選OX62+細胞，并檢測細胞表面抗原CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、OX62的表達。同時對陰選OX62-細胞檢測CD3、CD4、CD8表達及Treg細胞數量。

1.3.7移植心臟石蠟包埋切片與蘇木精-伊紅(HE)染色 取移植心臟組織進行脫水，浸蠟，包埋，連續切片，伊紅染色，光學顯微鏡下觀察心臟顯色結果。

2 結果

2.1大鼠BMSCs鑒定結果超過90%大鼠BMSCs可以表達CD29、CD44、CD90、CD73。但不表達CD45、CD11b、CD34。

2.2RT-PCR檢測IDO基因的表達結果定量PCR結果顯示，大鼠BMSCs中，OE組IDO基因表達豐度為NC組的62 906.27倍(P<0.05)，見圖1。

圖1 慢病毒轉染大鼠BMSCs中并加入基因開啟劑DOX 2 d后IDO基因的表達與NC組比較：*P<0.05

2.3心臟彩超評價移植心臟可見腹腔異位心臟移植模型建立3 d，移植心臟仍然跳動，局部形成血栓，見圖2。

圖2 腹腔異位移植心臟3 d后復查心臟彩超結果黃色箭頭指向的是形成的血栓；紅色箭頭指向的是移植心臟

2.4掃描電鏡檢測exosome結果可見BMSCs分泌出的exosome表現為白色，大小為介于50～100 nm的顆粒。見圖3。

圖3 ExoQuick-TC法提取exosome電鏡圖片 ×4 500

2.5心臟彩超評估注射exosome后移植心臟心功能異位腹腔移植心臟模型建立3 d后，通過受體大鼠尾靜脈注射各種BMSCs分泌的exosome，采用心臟彩超評估移植心臟心功能改變，可見給予過表達IDO-BMSCs分泌的exosome處理后2 d，移植心臟的EF、FS均有顯著提高，與其余各組差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.6采用小動物活體成像評估注射exosome后移植心臟熒光強度大鼠心臟移植模型建立3 d后給予受體大鼠注射過表達IDO-BMSCs-exosome、空載體-BMSCs-exosome、BMSCs-exosome后2 d完成小動物活體成像，將嗎替麥考組及未處理組做為對照組。可見過表達IDO-BMSCs-exosome組移植心臟局部熒光強度與其他各組比較差異有統計學意義(P<0.05)，其熒光強度最強。見圖4。

2.7流式細胞技術評估注射exosome后受體大鼠脾臟細胞表面抗原分子過表達IDO-BMSCs-exosome組CD40、CD86、CD80、MHCII、CD45RA、CD45RA+CD45RB表達量最低，與其他各組比較差異有統計學意義(P<0.05)。過表達IDO-BMSCs-exosome組CD274表達量最高，與其他組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。過表達IDO-BMSCs-exosome組Treg細胞量最高，與其他組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

將上述CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、Treg表達行單因素方差分析：CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB的表達及Treg細胞數量差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

圖4 給予干預措施2 d后評價移植心臟局部熒光強度評價1.過表達IDO-BMSCs-exosome組；2.空載體-BMSCs-exosome組；3.BMSCs-exosome組；4.嗎替麥考組；5.未處理組；與空載體-BMSCs-exosome組比較：***P<0.001；與BMSCs-exosome組比較：###P<0.001；與嗎替麥考組比較：▽▽▽P<0.001；與未處理組比較：△△△P<0.001

表1 給予exosome處理2 d后移植心臟功能評價

與空載體組比較：*P<0.05；與BMSCs組比較：#P<0.05；與嗎替麥考組比較：▽P<0.05；與建模未處理組比較：△P<0.05

圖5 給予干預措施2 d后流式檢測脾臟細胞抗原分子表達與空載體-BMSCs-exosome組比較：*P<0.05；與BMSCs-exosome組比較：#P<0.05；與嗎替麥考組比較：▽P<0.05；與未處理組比較：△P<0.05；與正常組比較：▼P<0.05

圖6 HE染色評估移植心臟炎性細胞侵襲結果 ×400A：過表達IDO-BMSCs-exosome組；B：空載體-BMSCs-exosome組；C：BMSCs-exosome組；D：嗎替麥考組；E：未處理組；F：正常組

2.8移植心臟蘇木素-伊紅染色結果未處理組中炎性細胞浸潤心肌數量高于其余各組，而過表達IDO-BMSCs-exosome處理組炎性細胞數量少于其它各組。見圖6。

3 討論

間充質干細胞(MSCs)可以調節免疫排異反應，目前研究發現其通過以下途徑完成：① MSCs不表達主要組織相容性抗原-Ⅱ及細胞表面免疫協同分子，但可持續不斷表達低水平MHC-Ⅰ分子。② MSCs可抑制B、T淋巴細胞的增生和激活。也能通過細胞因子(如：IL-6、M-CSF)影響樹突狀細胞的功能及成熟。③ MSCs也能分泌抗炎因子和改變損傷組織處免疫細胞表面抗原分子表達，從而保護炎癥處組織免除排異反應損傷[7]。

IDO可通過三條主要途徑實現免疫調節：① IDO能分解色氨酸并產生毒性代謝產物犬尿氨酸，而淋巴細胞通過攝取犬尿氨酸使細胞進入G1期促進細胞凋亡；② IDO通過消耗色氨酸激活免疫細胞中抑制免疫敏感轉錄信號途徑[8]；③ IDO也可通過在DCs上直接表達出IDO做為細胞與細胞間信號分子[9]。IDO的功能可不依賴IDO酶活性。通過IDO與Src原癌基因抗體同族第二域(SHP-1/SHP-2)與磷酸酯酶(phosphatase)互相接觸，激活IDO中免疫調節區域而發揮抗免疫排異作用。IDO-SHP復合體是轉錄生長因子-β(TGF-β)發揮對血漿樹突狀細胞調節免疫排異的關鍵因素[10]。

前期研究[4]證實過表達IDO-BMSCs可以有效抑制免疫排異反應。但經過基因改造的BMSCs應用于臨床仍然遙遙無期。因而我們將目光聚焦于外泌體。exosome是一種大小介于50～100 nm囊泡，其內含有多種蛋白質及RNA。早期認為其是一種細胞代謝產物，細胞可以以外泌體的形式扔掉自身不需要的蛋白和RNA,exosome可以通過在細胞與細胞不直接接觸下遠距離進行細胞間生物信號傳導包括免疫信號傳導[11]。研究[12]顯示當細胞暴露于一種應激條件下能夠改變與免疫有關的miRNA，同時也證實，exosome中有HSP72和miRNA的表達。Wang et al[13]報道外泌體中富含的miRNA能夠與mRNA 5’端連接，從而抑制目標基因表達。因此，一條miRNA可以與多條mRNA相互作用從而抑制免疫蛋白表達。本研究也證實免疫細胞表面抗原分子表達發生改變。

研究采用二維心臟超聲檢測，可見過表達IDO-BMSCs-exosome組移植心臟EF、FS較其他各組有顯著提高；小動物活體成像技術檢測移植心臟局部熒光強度，可見過表達IDO-BMSCs-exosome組中移植心臟具有更強熒光強度；流式細胞檢測免疫細胞表面抗原分子改變，可見過表達IDO-BMSCs-exosome組受體大鼠脾臟淋巴細胞中CD40、CD86、CD80、主要組織相容性抗原II、CD45RA、CD45RA+CD45RB表達降低，而CD274(PDL-1)表達增高。Treg細胞的數量增多。HE染色檢測移植心臟局部淋巴細胞浸潤減少。