嗎啡與布托啡諾對肺腺癌細胞A549侵襲與遷移的影響

李 彬,薛 昀

目前肺癌主要的治療方法為手術、放化療及生物靶向治療等綜合治療，而患者的主要死亡原因是腫瘤的復發和轉移。研究[1-2]表明，阿片類藥物對腫瘤的發展有一定的影響，其中μ受體及其激動劑可能促進腫瘤生長；而κ受體激動劑則抑制腫瘤生長。腫瘤患者在圍術期鎮痛及癌痛治療中嗎啡作為鎮痛藥物“金標準”被大量使用。嗎啡為μ受體激動劑，是否促進腫瘤的侵襲及遷移；布托啡諾為κ受體激動劑是否抑制腫瘤的侵襲及遷移，目前這一領域的研究資料還較少，且研究方法不統一[3-4]。同時新型的阿片類藥物開始用于臨床麻醉和鎮痛，對腫瘤的短期作用和長期影響亟待研究。該研究旨在探討嗎啡與布托啡諾對人肺腺癌細胞A549的侵襲及遷移的影響，以及對相關蛋白表達的作用機制，期望有助于優化臨床用藥習慣及改善肺癌患者術后生存。

1 材料與方法

1.1實驗對象及分組人肺腺癌A549細胞購自中科院上海細胞庫，接種于培養板，培養24 h后，隨機分為嗎啡組與布托啡諾組。每組分別設置不同濃度組：對照組(生理鹽水)、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L。同時在嗎啡組與布托啡諾組的基礎上分別設置兩組對應的特異性拮抗劑組：嗎啡+甲基納曲酮，布托啡諾+Nor-Binaltorphimine (Nor-BNI)；鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，1 ml ∶10 mg，國藥準字H20013351)；甲基納曲酮(上海意杰生物科技有限公司，5 mg，國藥準字A3596)；布托啡諾注射液(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，2 ml ∶4 mg，國藥準字H20143106)；Nor-BNI(博奧派克生物，10 mg，貨號ab120078)。每組分別加入對應濃度藥物后孵育36 h，檢測其侵襲及遷移能力。

1.2試劑與儀器胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司；RPMI-1640細胞培養液購自美國GibcoBRL公司；二甲基亞砜(DMSO，分析純)購自江蘇鴻聲化工廠；Western blot試劑(抗體稀釋液和抗體去除液)、免疫熒光試劑(細胞核熒光染液DAPI)購自上海碧云天公司；ECL發光液購自美國Thermo Scientific公司；免疫組化試劑(SP9000通用型組化試劑盒、DAB顯色劑)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；蘇木精、伊紅等染色液及Triton X-100購自北京索萊寶生物公司；PVDF膜(0.45 μm)購自美國Millipore公司；3111型CO2培養箱、CL17R型冷凍高速離心機購自美國Thermo Forma公司；低溫冰箱購自臺灣SANYO公司；SENCO R-201旋轉蒸發儀購自上海中順生物科技有限公司；細胞培養板和培養瓶購自丹麥NUN CLON公司；XPS-18型倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；Western blot檢測系統與凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；Leica Bond-Max免疫組化儀購自北京昊諾斯科技有限公司(德國生產)。

1.3Transwell法檢測細胞侵襲能力將凍存于-20 ℃的Matrigel與無血清培養液1 ∶6稀釋，每孔15 μl加入Transwell小室，37 ℃靜置1 h。轉染24 h消化后，1 000 r/min離心1 min，去上清液，加入各組無血清培養液及1×105個細胞，用DMEM稀釋至400 μl，每組設3個復孔。向小室下層加入含10% FBS DMEM的600 μl培養液，培養在含5% CO2、37 ℃恒溫箱24 h。然后吸去嵌室內液體，用PBS洗3次，加入90%乙醇固定30 min，吸出乙醇后PBS洗2次，用0.1%結晶紫染色30 min，風干后，熒光顯微鏡下(×200)隨機選擇5個視野拍照并計平均數。

1.4細胞劃痕法檢測細胞遷移將A549細胞接種到6孔板，細胞密度為鋪滿培養板80%時轉染，轉染6 h后換液，繼續培養至細胞長滿培養板，用20 μl槍頭垂直于細胞平面劃痕，用PBS洗5次，洗去細胞殘留，更換培養基，以劃痕時間點記做0 h，每隔12 h拍照。各樣品均取5個視野測量距離。細胞遷移率(%)=(0 h時劃痕距離-24 h時劃痕距離)/0 h時劃痕距離×100%。

1.5Westernblot實驗每組1×107個細胞，加入預冷蛋白裂解液200 μl，4 ℃下裂解1 h，冰浴下超聲裂解15 min，12 000 r/min離心20 min，上清液用BCA定量試劑盒測定基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2、MMP-9、成束蛋白(Fascin)的濃度。利用8% SDS-PAGE電泳50 μg總蛋白，轉膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入1 ∶1 000稀釋的小鼠抗人單克隆抗體，4 ℃孵育12 h。接著TBST清洗3次，每次10 min，加入1 ∶3 000稀釋的山羊抗小鼠HRP標記二抗，重復以上清洗，最后采用Pierce公司生產的超敏ECL試劑暗室曝光檢測蛋白條帶。

2 結果

2.1布托啡諾和嗎啡對A549細胞侵襲能力的影響與對照組比較，隨著布托啡諾劑量的增加，A549細胞侵襲數明顯減少，而隨著嗎啡劑量的增加A549細胞侵襲數明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明布托啡諾可抑制肺腺癌細胞的侵襲能力，而嗎啡反之。見圖1。

2.2各組細胞培養0、12、24h的遷移情況比較與對照組比較，隨著布托啡諾劑量的增加及時間延長，A549細胞遷移變化不明顯，而隨著嗎啡劑量的增加A549細胞遷移數明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明布托啡諾可抑制肺腺癌細胞的遷移能力，而嗎啡反之。見表1和圖2、3。

表1 各組細胞遷移率的比較

與對照組比較：*P<0.05；與0.1 μmol/L比較：#P<0.05；與1 μmol/L比較：△P<0.05

圖1 布托啡諾與嗎啡對A549細胞侵襲能力的影響 ×200A：布托啡諾；B：嗎啡；1：對照組；2：0.1 μmol/L;C:1 μmol/L;D:10 μmol/L

圖2 各組細胞培養0、12、24 h的遷移情況比較 ×100A：布托啡諾；B：嗎啡

圖3 各組細胞遷移率的比較

2.3Transwell法檢測加入拮抗劑各組的侵襲能力與對照組比較，隨著布托啡諾特異性拮抗劑Nor-BNI劑量為0.1 μmol/L時，A549細胞侵襲數明顯增加，而1 μmol/L與10 μmol/L的劑量變化不明顯。與單純布托啡諾組對應的劑量比較，可明顯觀察到加入Nor-BNI后，每組對應劑量的A549細胞侵襲數明顯增加。與單純嗎啡組對應的劑量比較，隨著嗎啡特異性拮抗劑甲基納曲酮劑量的增加，A549細胞侵襲數明顯減少。結果表明布托啡諾可抑制肺腺癌細胞的侵襲能力，而嗎啡反之。見圖4。

圖4 Transwell實驗檢測培養24 h布托啡諾+Nor-BNI與嗎啡+甲基納曲酮對A549細胞侵襲能力的影響 ×200A：布托啡諾+Nor-BNI；B：嗎啡+甲基納曲酮；1：對照組；2：0.1 μmol/L;C:1 μmol/L;D:10 μmol/L

2.4Westernblot檢測MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表達與對照組比較，10 μmol/L布托啡諾作用肺腺癌A549細胞24 h后，MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白表達下調，而嗎啡作用后MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明布托啡諾可以抑制肺腺癌細胞的遷移能力，而嗎啡反之。見圖5、6、表2。

圖5 Western blot法檢測各穩定轉染細胞系MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表達

圖6 10 μmol/L布托啡諾與嗎啡作用肺腺癌A549細胞24 h后MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表達

表2 10 μmol/L布托啡諾與嗎啡作用肺腺癌A549細胞24 h后MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表達

t1、P1：10 μmol/L嗎啡與對照組比較；t2、P2：10 μmol/L布托啡諾與對照組比較

3 討論

研究[5]顯示術后阿片類藥物的使用可能會增加癌癥的復發，降低Ⅰ期和IIa期非小細胞型肺癌(NSCLC)患者的存活率。另一項研究[6]也表明術后μ受體激動劑可降低整體生存率和早期NSCLC患者的無病生存時間。然而，Cata et al[7]卻發現靜脈或者硬膜外鎮痛的NSCLC患者在2年或5年生存率方面沒有顯著差異。目前，阿片類受體激動劑是目前最常用的癌癥慢性疼痛及圍手術期的止痛藥，如嗎啡為阿片μ受體激動藥，而布托啡諾則是κ受體激動劑。對于μ受體激動劑而言，一方面可通過抑制機體免疫力，同時促進術后殘留癌細胞的存活而增加癌癥復發率；對于κ受體激動劑而言，可能通過降低肺癌細胞糖原合成激酶3β的磷酸化從而抑制NSCLC細胞生長[8]。近年來，阿片類鎮痛藥物對肺癌的作用機制受到國內外關注，但爭議較大[9]。研究[10]顯示嗎啡、布托啡諾等對腫瘤轉移和侵襲有一定的影響，并表明不同的麻醉藥物及濃度對不同類型的腫瘤細胞的影響差異較大。本研究顯示，隨著嗎啡濃度的增加對促進肺腺癌細胞A549的侵襲和遷移能力逐漸增強。

目前MMP家族中明膠酶MMP-2、MMP-9是研究較普遍的2種[8]。研究[9]表明，MMP-2、MMP-9的表達對腫瘤的侵襲和轉移有影響。嗎啡在腫瘤細胞侵襲和遷移中的作用仍存在較多爭議，有促進或抑制轉移侵襲的結果[11]，而布托啡諾多用于胃癌、肝癌、食管癌等術后自控鎮痛、鎮靜，在腫瘤的轉移和侵襲方面國內沒有相關報道。本研究顯示，嗎啡促進肺腺癌細胞A549的侵襲和遷移，并上調了MMP-2、MMP-9的表達；而布托啡諾反之，這與阿片類藥物μ受體及其激動劑可能促進腫瘤生長；而κ受體激動劑則抑制腫瘤生長較一致。成束蛋白Fascin在腦、卵巢等組織中呈高表達，其在不同類型細胞中表達不同[12]。韓鐵鵬 等[13]發現無論鱗癌還是腺癌，Fascin蛋白高表達與腫瘤的分期，淋巴結轉移和患者預后顯著相關，而且Fascin蛋白高表達是早期NSCLC患者預后的獨立危險因素。本研究顯示，嗎啡明顯上調了肺腺癌細胞A549中Fascin蛋白的表達；而布托啡諾反之，而具體的作用機制需研究藥物作用的藥代動力學、靶點相關基因表達及相關蛋白受體的表達，阿片μ受體的多態性，同時學習μ受體和κ受體表達的表達水平對于不同患者肺癌預后的影響[11]。

Oosten et al[14]研究了癌癥患者嗎啡代謝的藥代動力學表明，血藥濃度與治療結果呈正相關性。Afsharimani et al[15]認為所用模型間差異導致目前嗎啡對癌細胞轉移和侵襲性的差異性結論。本研究顯示，嗎啡促進肺腺癌細胞A549的侵襲和遷移，而布托啡諾反之，這與阿片類藥物μ受體及其激動劑可能促進腫瘤生長，而K受體激動劑則抑制腫瘤生長較一致。這不排除其是共同作用的通路，但具體機制仍有待進一步研究。同時，本研究在不同濃度的嗎啡與布托啡諾中加入對應的特異性拮抗劑，顯示布托啡諾可抑制肺腺癌細胞的侵襲能力，而嗎啡反之。

綜上所述，嗎啡可促進肺腺癌細胞A549的遷移與侵襲，而布托啡諾則抑制肺腺癌細胞A549的遷移與侵襲，可能與MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白表達相關，但具體機制有待進一步探究。