NaCl脅迫下zma-miR059的表達及其抗鹽性分析

王 紅， 毋若楠， 王爭艷， 楊成成， 武永軍

(西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊陵 712100)

土壤鹽漬化導致環境退化，嚴重影響著作物的生長及產量。土壤中鹽離子濃度過高會造成植物根系吸水困難，使植物體內含水量下降，膨壓降低，引起植物細胞脫水死亡，甚至影響植物自身的生存[1]。目前，我國大約有0.33億hm2鹽堿地，而大量農作物耐鹽性差，在鹽堿地中無法種植，因此，如何提高農作物的耐鹽性，對擴大我國耕地面積具有現實意義。

miRNAs是植物體內普遍存在的一類小分子非編碼RNA，其長度在24 nt左右[2]。miRNAs廣泛參與植物的生長發育、形態建成、果實發育、對生物和非生物脅迫的響應等過程[3]。研究發現，擬南芥[4]、玉米[5]中都存在響應鹽脅迫的miRNAs。目前研究miRNAs功能的方法有過表達和基因沉默等。向娟等發現，在擬南芥中過表達番茄的miR397能夠增強擬南芥的抗旱性[6]。2014年Gu等構建了沉默miR165/166的STTM(short tandem target mimic，即短串聯靶標模擬)載體，導致轉基因棉花中靶標基因的表達量明顯上升[7]。

當土壤環境中鹽離子濃度較高時，會破壞植物細胞內的離子平衡，引起膜功能異常，代謝活動減弱，從而影響生長[8]。當植物受到非生物脅迫時，活性氧積累且高度活躍，刺激植物通過抗氧化酶級聯反應來清除活性氧[9]，使植物體內清除活性氧相關酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)、過氧化物酶(peroxidase，簡稱POD)、過氧化氫酶(catalase，簡稱CAT)等活性升高[10-11]。此外，在脅迫下，細胞膜會發生膜脂過氧化，產生丙二醛(malonaldehyde，簡稱MDA)，因此，可以通過丙二醛了解膜系統受傷害的程度[12]。保護酶活性及MDA含量已被廣泛用來衡量植物受脅迫的程度。

筆者所在實驗室在之前利用高通量測序研究了NaCl處理下玉米miRNAs的表達，發現zma-miR059的表達量在NaCl脅迫下顯著上升。因此本研究以先玉335為試驗材料，試圖明確zma-miR059與鹽脅迫的關系，以期為從轉錄后調控角度改進植物的耐鹽性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米品種和接種的菌株 玉米品種為先玉335，載體pOT2-Poly-cis、pFGC5941-PacI和農桿菌GV3101為筆者所在實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理和樣品采集 將玉米種子進行消毒、萌發處理，當玉米芽長到2 cm時，用棉花包裹種子，留出根部，插入自制的玉米水培盆小孔中，每天用通氣泵通氣3次。用蒸餾水培養3 d后換Hoagland培養液培養至三葉期，挑出長勢一致的玉米幼苗進行處理。分根處理(將玉米根系分為大致相等的2個部分)：將2個部分的根分別放入正常的Hoagland培養液和含有200 mmol/L NaCl的Hoagland培養液中。全部根系NaCl處理：將玉米根系全部放入含有200 mmol/L NaCl的Hoagland培養液中。對照：將全部根系放入不含NaCl的Hoagland培養液中，培養2 d后，取樣進行試驗，每個處理設置3個重復。

培養條件：光—暗周期為15 h—9 h，晝—夜溫度周期為28 ℃—20 ℃。

1.2.2 RNA提取和反轉錄 用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取葉片和根系總RNA。提取RNA后用GoScriptTMReverse Transcription System(Promega，上海)進行反轉錄，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。反轉錄參照Chen等發明的stem-loop RT-PCR，設計反轉錄引物：5′-GTCGTA TCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGAC GATC-3′(5′末端是44個固定堿基，3′末端的8個堿基與miRNA成熟體的3′端互補配對)[13]。反應體系為20 μL：2.5 μL 總RNA、4 μL反應緩沖液、1 μL反轉錄引物、2 μL MgCl2、1 μL dNTPs、1 μL RNA酶抑制劑、1 μL 反轉錄酶，7.5 μL 水。反應條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，75 ℃ 15 min。

1.2.3 實時定量PCR 實時熒光定量PCR采用Promega公司的GoTaq?qPCR Master Mix，操作嚴格按照說明書進行。選擇18S rRNA為內參，zma-miR059和內參的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。反應體系為 20 μL：10 μL 2×GoTaq?qPCR Master Mix，7.4 μL水，各 0.3 μL 上、下游引物(10 μmol/L)，2 μL cDNA。反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。在65～95 ℃，每升高0.5 ℃采集1次熒光，生成溶解曲線。每個樣品設置3個重復，陰性對照以ddH2O為模板。表達量采用相對定量2-ΔΔCT法計算。

表1 實時定量PCR引物

1.2.4 SOD、CAT、POD活性及MDA含量的測定 參照高俊鳳的方法進行CAT、SOD、POD活性和MDA含量的測定，均為鮮質量活性或含量[14]。

1.2.5 zma-miR059 STTM表達載體的構建 zma-miR059的序列為5′-ATCATGGCAGTGAGATCGTCG-3′，參照Yan等的方法[15]設計zma-miR059的STTM序列，整段序列如下：5′-CATTTGGAGAGGACAGCCCCGACGATCTCATAGCTG CCATGATGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTA AAGAAGAAGAATCGACGATCTCATAGCTGCCATGATGGTACG CTGAAATCACCAG-3′。根據上述序列設計引物，構建STTM-zma-miR059表達載體，引物序列詳見表2。

表2 構建STTM-zma-miR059的引物

以pOT2-Poly-Cis質粒為模板，PCR擴增STTM(KOD-Plus-Neo，日本)，對PCR產物進行回收純化[天根生化科技(北京)有限公司]，用Swa[New England Biolabs(NEB)公司，美國]酶切產物，4 ℃過夜自連，轉化TOP10感受態細胞[天根生化科技(北京)有限公司]，用卡那霉素(Kan)篩選，選擇陽性菌落以STTM-F、STTM-R為引物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序，進行BLAST比對。

以連接成功的pOT2-STTM為模板，PCR刪除復制起始位點，將產物回收純化，用PacI[New England Biolabs(NEB)公司，美國]酶切pFGC5941-PacI和PCR片段，為了防止載體自連，用pFGC5941-PacI酶切120 min后再在體系中加入1 μL堿性磷酸酶(NEB，USA)處理30 min，純化，4 ℃過夜連接，轉化TOP10感受態細胞，篩選重組載體pFGC5941-STTM，選擇陽性菌落，以STTM-F、STTM-R為引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，進行BLAST比對。測序驗證正確后用液氮速凍法將重組質粒轉化到農桿菌GV3101中。

2 結果與分析

2.1 NaCl處理對zma-miR059表達的影響

由圖1可以看出，NaCl脅迫下玉米葉片、根系中的zma-miR059表達量均明顯上升。全根NaCl處理下，葉片表達量是對照葉的3.71倍，根系表達量是對照根系的3.75倍。zma-miR059在分根NaCl處理下的葉片和鹽處理側根系中的表達水平也上升，但沒有全根NaCl脅迫下的上升明顯。分根NaCl處理組葉片的表達量比對照葉片上調了120%，鹽處理側根系的表達量比對照根系上調了85%，水處理側根系的表達量與對照根系相當。結果顯示，在NaCl脅迫下zma-miR059的表達量明顯上升，與前期高通量測序結果一致，進一步表明zma-miR059是一個新的與NaCl脅迫相關的miRNA。

2.2 NaCl處理對玉米SOD、POD、CAT活性和MDA含量的影響

如圖2-A所示，用NaCl處理后，玉米幼苗的葉片和根系中SOD活性均有所提高。NaCl處理對葉片中SOD活性的影響比對根系中SOD活性的影響更大；SOD活性在對照、分根NaCl處理和全根NaCl處理葉片中呈現出明顯的上升趨勢，且在全根NaCl處理的玉米葉片中SOD活性達到最大值；處理組根系中的SOD活性雖然也增加了，但沒有葉片增加得明顯。

NaCl處理能夠在一定水平上影響幼苗的POD活性。如圖2-B所示，NaCl處理后，葉片中的POD活性變化并不明顯，其中分根NaCl處理呈現出微小的下降趨勢。但是全根、分根NaCl處理的幼苗根系中POD活性均增加。

如圖2-C所示，與POD、SOD的活性變化不同，NaCl處理后玉米幼苗根系和葉片中的CAT活性明顯降低，特別是在全根NaCl處理的玉米幼苗中，CAT活性在其葉片中有明顯降低，這與鄭世英等的研究結果一致[16]。

如圖2-D所示，NaCl處理對玉米幼苗的葉片和根系中MDA含量影響明顯，全根NaCl處理的葉片中MDA含量是對照葉片中的4.25倍，分根NaCl處理的葉片中MDA含量是對照的2.06倍。全根NaCl處理的根系中MDA含量增加了 2.91 倍，分根處理的根系中MDA含量增加了2.01倍。經NaCl處理后，MDA含量在玉米幼苗葉片和根系的對照組、分根NaCl處理組及全根NaCl處理組中均呈現出明顯的上升趨勢。

2.3 zma-miR059-STTM表達載體的構建

按照第“1.2.5”節中描述的方法進行載體構建，對重組質粒進行菌落PCR或酶切鑒定，鑒定正確后通過測序最終確定STTM的序列。由圖3可以看出，1、2、3泳道檢測到的菌落PCR片段大小為134 bp，與預期大小一致，表明連接成功。由圖4可以看出，酶切片段為刪除pOT2-STTM復制起始位點的PCR片段，大小為2 837 bp，與PCR片段一樣，說明 pFGC5941-STTM重組質粒連接成功。測序比對后顯示序列正確，表明zma-miR059-STTM的表達載體構建成功。

3 討論與結論

miRNA以調控靶標的方式在轉錄后水平參與植物對逆境脅迫的響應[17]。Ding等研究發現，用鹽處理玉米根系時，miR166、miR319、miR395、miR399等表達水平顯著改變[5]。本試驗結果顯示，用NaCl處理玉米幼苗時，葉片、根系的 zma-miR059表達量均升高，表明zma-miR059可能是玉米抗鹽性相關的miRNA。此外，分根處理的玉米幼苗葉片和根系中zma-miR059的表達量低于全根NaCl處理，表明分根處理能夠在一定程度上緩解玉米的脅迫情況，從而影響 zma-miR059的表達量。

植物體內的SOD、CAT和POD等抗氧化酶是檢測活性氧代謝的生物標志物[18-20]，MDA在植物受到傷害后產生，植物受外界脅迫越強，MDA含量越高[12，21-22]，因此MDA含量及保護酶活性可以用來評判植物對外界脅迫的抵抗能力。全根NaCl處理和分根NaCl處理后，玉米幼苗葉片、根系中的SOD、POD活性均增加，表明NaCl脅迫導致植物體內膜脂過氧化、活性氧積累，而SOD等保護酶活性的增強可以有效清除活性氧，提高對脅迫的抵御能力。分根NaCl處理的玉米幼苗酶活性增加程度明顯低于全根NaCl處理，表明在NaCl濃度相同時，分根NaCl處理的膜脂過氧化程度低于全根NaCl脅迫，分根處理會在一定程度上緩解植物的膜脂過氧化水平。NaCl處理后，玉米幼苗的葉片、根系中MDA含量明顯增加，分根NaCl處理的玉米幼苗中MDA含量均低于全根NaCl處理，因此可見全根NaCl處理比分根NaCl處理會更大程度地損害植物膜系統。zma-miR059在根中的表達量變化趨勢與MDA含量、POD活性變化趨勢基本相同，都是脅迫后上升，且全根NaCl處理比分根處理增加幅度更大，進一步說明 zma-miR059 與玉米抵抗鹽脅迫相關。

Yan等構建miR165/166的STTM載體侵染擬南芥后，出現了植株葉片不規則、矮小、彎曲的表型[15]，與FranCo-Zorrilla等構建的TM載體[23]相比，Yan等構建的突變體沉默效率更高[15]。本試驗表明，zma-miR059是1個與玉米鹽脅迫相關的miRNA，為了進一步研究zma-miR059的作用機制，揭示其功能，筆者構建了STTM載體，并進行了農桿菌轉化，下一步將獲得STTM-zma-miR059轉基因玉米，期望通過轉基因玉米試驗進一步明確zma-miR059與抗鹽性的關系。