水稻Ds標記的矮稈突變體的分子鑒定

郭妍妍， 趙丁丁， 孫丙耀

(蘇州大學醫學部基礎醫學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123)

水稻作為主要的糧食作物和分子生物學(單子葉植物)研究的模式植物，隨著其全基因組序列的公布[1]，尋找和認識新型水稻功能基因已經成為水稻功能基因組學的重要研究任務。通過構建突變體庫，以突變基因為研究對象分析水稻基因功能，是一條有效的研究捷徑。產生水稻突變體的方法主要有T-DNA插入、理化誘變、轉座子插入等[2-7]。其中，利用Ac/Ds插入產生水稻突變體，并以TAIL-PCR技術克隆突變位點側翼序列尋找功能基因得到了廣泛應用。國內外許多研究單位構建了多個水稻Ac/Ds突變體庫，也從中分離到一些控制不同水稻性狀的基因[2-6]。矮稈作為重要的農藝性狀，矮稈基因的發現、研究和利用在“綠色革命”中起到至關重要的作用。但是目前為止，能夠在生產上實際應用的矮稈主基因只有sd-1。植物矮化常與赤霉素(GA)、油菜素類固醇(BR)的代謝有關[8-10]。GA是植物生長發育過程中一類重要的調節激素，對誘導α-淀粉酶的形成、莖的伸長和植株增高、節間和葉片的伸長、禾谷類種子的萌發、花器官的形成等都具有明顯的促進作用。目前，已有136種GA在植物、真菌、細菌中發現(http：//www.plant-hormones.info/gibberellins.htm)。GA的合成需要3種基本酶：GA2氧化酶、GA3氧化酶和GA20氧化酶。這3種酶都具有保守的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白結構域，屬于2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白超家族[11-14]。Lo等在水稻TRIM群中發現的GA2氧化酶6，也具有保守的2OG-Fe(Ⅱ)結構域[15]；Teng等在研究玉米第3號染色體上的GA3氧化酶2時，發現它是一個對玉米株高起主效作用的數量性狀基因座，編碼GA3-β羥化酶，與水稻GA3氧化酶2的同源性非常高[16]。尋找和發現新的能在生產上利用的矮稈資源以及研究矮生相關機制是水稻分子遺傳工作者的不斷追求。本研究利用已構建的Ac/Ds突變體系，篩選到矮稈表型突變體(mutant type，MT)，并且在矮稈突變體后代培育中出現株高回復突變植株(revertant type，RT)。由此，展開對未知矮稈基因的分子研究。希望通過對MT、RT株高控制基因的研究，揭示此未知基因的結構和功能。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

試驗材料來源于水稻品種Dongjin(OryzasativaL. var.japonicacv. Dongjin)的Ac/Ds插入突變株系[17](由韓國國立慶尚大學Han Chang-deok教授實驗室提供)，經過連續4代自交培育出現MT，MT后代自交培育，出現RT。本試驗以MT、RT作為試驗材料。

1.2 引物設計

采用PCR方法檢測Ac、Ds在水稻基因組上可能的插入，根據Ac、Ds的序列特點設計1對特異引物P1、P2，同時使用GUSBYF、GUSBYR作驗證。TAIL-PCR引物：Ds序列的3個特異引物SP1、SP2、SP3，分別與隨機簡并引物AD組成3對引物，用于TAIL-PCR的3個反應，擴增Ds插入位點側翼序列。Ds插入基因型分析引物：根據插入位點水稻序列特點設計特異引物F1、R1；利用前述引物SP3與R1組成1對引物，檢測Ds插入，從而分析Ds插入基因型(表1)。

1.3 基因組DNA的提取和Ds插入的PCR鑒定

基因組DNA的提取依照Sun等的方法[18]進行。

Ds插入的PCR鑒定：建立PCR反應體系，選擇特異引物P1、P2，94 ℃變性30 s， 58 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環，檢測有無Ac/Ds插入。同時，對GUS報告基因進行PCR鑒定，再次驗證有無Ac/Ds插入。

表1 PCR反應引物

1.4 Ds側翼序列的TAIL-PCR分析

對含Ac/Ds雙元件的樣品進行TAIL-PCR分析[18]：TAIL-PCR反應體系涉及的第1、第2、第3反應所采用的特異引物分別為SP1、SP2、SP3，隨機簡并引物為AD。反應結束后將第2、3輪反應的產物依次上樣于2%瓊脂糖凝膠電泳以選擇遷移條帶。

特異條帶的洗脫、純化和Ds側翼序列的測定：根據所設計的特異引物SP2、SP3在Ds序列上的間隔(36 bp)選擇第2、3輪反應產物中的特異遷移條帶。從凝膠中切出第3反應的條帶，回收純化，TA克隆測序。

1.5 Ds側翼序列的GenBank檢索和插入位點的基因分析

為分析Ds插入部位的水稻基因情況，將上述已測的Ds側翼序列用NCBI的Blast進行在線檢索(http：//www.ncbi.nih.gov/BLAST/)，確認Ac/Ds插入植株中Ds的染色體定位和插入部位水稻基因結構和編碼氨基酸序列。同時，利用FGENESH(http：//www.softberry.com/)和GeneMark.hmm(http：//opal.biology.gatech.edu/)推測殘留8個堿基足跡后的被插入基因的結構，獲得其編碼的氨基酸序列。

1.6 RT中Ds跳躍行為的分子驗證

Ds的跳躍往往會留下8～11個堿基的足跡。設計特異引物F1和R1進行PCR反應，對擴增條帶克隆測序，即可驗證有無足跡殘留。

2 結果與分析

2.1 水稻突變體主要表型差異

從圖1可以看出，株高突變體系MT、RT和野生型(wild type，WT)對照，表型差異主要表現在株高和旗葉傾角上。WT平均株高79.02 cm，旗葉傾角25.3°；MT平均株高 45.86 cm(野生型的58.04%)，旗葉傾角75.6°；RT平均株高74.13 cm(野生型的93.81%)，旗葉傾角44.1°(圖1-a、圖1-b)。另外，RT在回復株高的同時，出現1個新性狀，穎殼上出現雜斑(圖1-c)。根據水稻前4～5莖節長度比例的差異，Takeda將水稻矮稈突變體分為6類[19](圖1-d)。本研究中，MT和RT均屬于dn型突變體(圖1-e)。

2.2 PCR分析Ac/Ds在水稻基因組上的插入

本研究根據Ac、Ds元件的核酸序列特點設計1對特異引物，以基因組DNA為模板進行PCR擴增，分析基因組上是否存在Ac和Ds元件。圖2-a為采用特異引物P1、P2進行PCR擴增的結果，其中，擴增出約0.4 kb特異條帶的表明基因組中含Ac元件；擴增出約0.5 kb條帶的表明含有Ds元件。可見，MT和RT基因組中均有Ac/Ds雙元件。圖2-b為GUS驗證，即根據Ac/Ds雙元件上含有的GUS報告基因，設計特異引物PCR擴增，進一步驗證了MT和RT均有Ac/Ds雙元件插入。

2.3 Ds側翼序列的TAIL-PCR分析

對經上述Ac/Ds插入分析證實含Ac/Ds轉座元件的MT、RT進行TAIL-PCR，擴增Ds插入位點側翼序列，選擇“*”標示序列凝膠回收(圖3)，純化后將該片段連接到T載體上，經轉化大腸桿菌DH5α、藍白斑篩選、菌液PCR擴增驗證，再進行序列測定。

2.4 Ds側翼序列的GenBank檢索和水稻Ds插入位點的分析

將上述測得的Ds側翼序列的核苷酸序列用NCBI的Blast軟件進行在線檢索，發現Ds插入在水稻第3號染色體上，具體基因為Os03g0147400(Oryzasativajaponicagroup)，在其第3外顯子上，序列ID為BAS82290.1(圖4)。此基因編碼假擬氧化還原酶蛋白[19-20]，含有1個保守的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶結構域，屬于2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白超家族。該假擬氧化還原酶蛋白擁有469個氨基酸。

2.5 Ds跳躍行為

根據Ds插入位點旁側水稻序列特點，設計引物F1和R1，PCR擴增、克隆測序發現RT中有Ds轉座跳躍，并殘留“CATCATGA”8個堿基的足跡。插入位點水稻部分側翼序列：5′-G A C C A G G A G G C T T T G G T T G G C G C C T T T A G G G A T A A A -C A G C A G A G C A T G G C C A T A C A C C A C T A C C C T C C T T G C C G C C A C -C C A G A C A A G G T G A T C G G C A T C A C G C C G C A C T C C G A T G G T C T C G- G C C T G A C G C T G C T G C T G C A G C T C G A C G A C A C G C C C G G C C T G C- A G A T C A G G A A G G A T G G C A G G T G G T T A C C A G T G C G A C C T C G C -C C G G G C A C C T (Ds插入位點)T C A T C A T G A C A T C A T C A A T G T- C G C C G A C A T A C T C G A G G T C C T T A C C A A T G G C G C G T A C A A G A G- C G T C G A G C A C A G A G T A C T C G C G G A C G C A G A G A A A G G C C G A A- C C A C C A T C G T G A C A T T T C A T G A A G C C T A T G T C G A T G G A A T G G- T G A A G C C G A T C C C G G A G G T G C T C A A G C T C A A C G G A G C A G A G G- C A C G C T A C A A G T C C A T A G A A A G A A T T G A G T A T A T C A A G G G A A- A C T T T G T G G C G C T T T C T G A G G G G A C A C G A T T T C T G G A G A G C C- T T A A G A T A T A G -3′，方框標記的8個堿基即為殘留足跡。

本研究中RT的轉座機制屬于“內切酶模式”[7，21-24]。由圖5可知，首先核酸外切酶延5′→3′的方向，切斷水稻序列，Ds得以插入；同時在基因修復機制下，堿基互補配對，空缺堿基得以補全，從而多出8個堿基對；接著Ac提供轉座酶，幫助Ds切離(本研究材料Ds在切離的同時帶走2個旁側堿基，屬于“不干凈”切離)；伴隨Ds的切離，基因序列按5′→3′方向自發延伸，從而形成2個發夾環結構，這就需要內切酶的參與，內切酶在一定范圍內以一定幾率切割“發夾環”的不同位點，導致環結構的消除；DNA重新合成、修復，結果產生不同長度和排列的足跡。本研究材料中，內切酶在貢獻位點的下一個堿基處切割，修復完成后，出現2個堿基對的顛換。與野生型相比，Ds跳躍的結果是殘留8個堿基，并伴有1個(實際2個)堿基對的轉換。

3 討論與結論

由于Ds的插入導致編碼假擬氧化還原酶蛋白的基因正常功能改變，出現矮稈突變體(MT)。這種改變有2種可能：(1)Ds參與蛋白表達。Ds可參與該基因(也可能是其他基因)的正常表達，兩者形成一種“新的”基因；因為Ds條帶的加入導致原有氨基酸鏈的增加或改變其折疊結構等，產生一種新的蛋白，最終導致原來基因功能的改變。這種蛋白可能參與到水稻生理作用，也可能被其他酶降解，沒有發揮作用。(2)Ds不參與表達。只是因為長達4.6 kb的Ds核苷酸鏈的插入導致該基因表達的中斷，使其喪失正常表達功能，合成出其他有用或無用的蛋白。也可能因為Ds的插入，影響附近DNA鏈的空間結構，從而鏈式影響到周圍相關基因的表達，產生突變體MT。總之，不管哪種可能，都會改變該基因原有功能，導致該基因無法正常編碼假擬氧化還原酶蛋白。

RT中出現Ds跳躍，株高得以回復(與WT相差不到 5 cm)，同時伴有新性狀穎殼雜斑的出現。因為Ds的跳躍，編碼假擬氧化還原酶基因得以回復原有結構，但又有一點小差異，多了“CATCATGA”8個堿基。單從株高上分析，因為有Ds在該假擬氧化還原酶蛋白基因上切離，RT株高得以回復，接近野生型。結合MT因為有Ds在該基因的插入，表型矮化的特征，可以說明該編碼假擬氧化還原酶基因對株高的維持具有重要作用。現在難以確定的是RT中Ds跳躍后是插在了其他表達基因上，抑或插在非表達區，還是跳躍后被降解消失了，總之，Ds跳躍后的去向還有待研究。目前，使用 TAIL-PCR 的方法還沒有檢測到新的轉座位點，這就難以對該基因的功能作出更具體的判斷。因為可能是Ds跳躍后插入新的表達基因，從而產生無法預知的變化，比如RT出現的穎殼帶有雜斑就是佐證。

植物矮化常與GA、BR的代謝有關，尤其是GA。GA是植物生長發育過程中一類重要的調節激素，對莖的伸長和植株增高具有重要的促進作用。目前的研究顯示，在GA的合成中，有3種酶起到基本作用，GA2氧化酶、GA3氧化酶和GA20氧化酶，這3種酶都具有保守的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白結構域，屬于2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白超家族[11-14]，如黃瓜的GA2氧化酶、玉米的GA3氧化酶1、煙草的GA2氧化酶4、粳稻GA3-β羥化酶(即GA3氧化酶)等，都具有保守的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白結構域。

本研究中的假擬氧化還原酶，同樣具有保守的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白結構域，屬于2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶超家族，且從上述研究不難推斷，該蛋白可能對水稻株高的維持具有重要作用。本研究中的假擬氧化還原酶蛋白是否影響到GA的正常合成還有待進一步的研究和驗證，揭示該基因真正的功能和作用機制。