草甘膦對轉基因抗草甘膦大豆的安全性研究

陳銀竹， 丁 偉， 劉勝男， Muhammad Shahid khan，2

(1.東北農業大學農學院，黑龍江哈爾濱 150000； 2.白沙瓦農業大學，巴基斯坦白沙瓦 1599107)

近年來，基因工程技術發展勢頭迅猛，種植業中以轉基因抗草甘膦大豆的發展最為迅速。而大豆為我國重要的糧食作物，雜草防除一直是大豆種植過程中的重點問題。化學除草是大豆田防除雜草的重要手段，近幾年大豆田化學除草面積已達其播種面積的90%以上[1]。轉基因抗草甘膦大豆的出現便為人們提供了一種能有效控制雜草的新途徑，不僅大大降低了除草成本和勞動強度，并且有效延緩了大豆田抗性雜草的出現，除草劑藥害的發生也明顯降低，已成為美洲地區大豆田雜草防除的重要方法之一。草甘膦由美國孟山都公司研制開發，目前是世界上除草劑使用量最大的品種之一[2]。草甘膦通過抑制莽草酸途徑中的5-烯醇式丙酮莽草酸-3- 磷酸合成酶(EPSPS)，使微生物和植物不能合成生存必需的芳香族氨基酸而導致死亡[3-4]。其特點是殺草譜廣、傳導性好、殘效低，在轉基因抗草甘膦大豆整個生育期都可以使用。國內外普遍將草甘膦應用于莖葉處理，而對應用草甘膦進行種子處理的安全性和雜草防除效果鮮有研究。本試驗通過草甘膦種子處理和莖葉處理研究草甘膦的安全性，為減少草甘膦的用量和我國當前自主研發的轉基因抗草甘膦大豆的安全應用提供理論依據。

已有的研究表明，一定濃度的草甘膦會造成轉基因大豆葉片的葉綠素含量降低、葉綠體結構變化和光合速率下降，葉綠素恢復過程需要2周左右，莽草酸含量幾乎沒有變化[5-11]。Bellaoui等研究表明，草甘膦會影響轉基因抗草甘膦大豆的碳代謝和氮代謝[12]。種子用草甘膦溶液浸泡后播于土壤中，敏感的大豆種子浸泡4 h后不能發芽，而轉基因種子均能順利發芽生長[13-14]。草甘膦莖葉處理能有效控制雜草，但噴施超過推薦劑量1.23～2.46 kg a.i./hm2會降低成熟期的單株粒數和單株產量[15]。美國研究證明，在田間無草的條件下，抗草甘膦大豆平均減產5%～10%，但由于雜草防效提高，最終抗草甘膦大豆產量增加[16]。本研究通過對草甘膦種子處理和莖葉處理來研究轉基因抗草甘膦大豆的安全性，期望降低草甘膦用量的同時獲得理想的田間雜草防除效果，從而為草甘膦的合理應用及我國自主研發轉基因大豆在生產中的安全應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

供試大豆為轉基因抗草甘膦大豆呼交06-698，供試除草劑為41%草甘膦異丙胺鹽水劑(美國孟山都公司)。

試驗于2015年于5—10月在東北農業大學轉基因試驗地進行。采用隨機區組試驗設計，41%草甘膦異丙胺鹽水劑設4個處理水平，每個處理4次重復(表1)。莖葉處理在大豆第1張復葉完全展開后施藥(此時為種子處理后33 d)，出苗后按照常規方式進行田間管理，在莖葉處理后7、14、21、28 d(DAT)記錄各處理內雜草數，同時取樣測定大豆生理指標，連續4次取樣完畢后對各處理內雜草進行稱質量。

表1 草甘膦用量

1.2 測定指標與方法

1.2.1 除草效果的計算 草甘膦莖葉處理后7 d和草甘膦種子處理播種后40 d，每隔7 d監測各處理雜草數量，計算雜草株防效及鮮質量防效。計算公式如下：

1.2.2 生理指標的測定 草甘膦莖葉處理后7 d和種子處理播種后40 d，取樣測定各處理單株大豆株高、鮮質量、干質量、葉綠素含量、光合速率和莽草酸含量。

參照丁偉等提出的分光光度比色法測定大豆葉綠素含量[17]。量取5 mL二甲基亞砜(DMSO)加入到干凈的血清瓶中，稱質量，將大豆葉片新鮮組織加入血清瓶中，再稱質量，放入暗室浸提。浸提24 h后，移取1 mL浸提液加入到5 mL的DMSO中混勻。在波長645、663 nm下用空白做對照測定吸光度，計算葉綠素含量：

式中：D1為645 nm處吸光度；D2為663 nm處吸光度；V1為樣品提取液總體積(mL)；K為樣品顯色稀釋倍數；m為樣品質量(g)。

光合速率采用美國LI-6400XT便攜式光合速率測定儀測定。Li-6400XT葉室CO2濃度設定為 400 μmol/mol，溫度為22.5 ℃，空氣相對濕度為40%～50%。選擇晴天09：00—11：00，測定各處理大豆的光合速率。

莽草酸含量的測定參照Cromartie等的方法[18]，通過分光光度計進行測定。取樣放于冰盒中帶回進行測定。測定時，取0.1 g樣品剪成碎片放入小瓶中，然后加 0.25 mol/L HCl溶液到2 mL，浸泡90 min，期間每隔30 min晃動1次。向試管中加2 mL氧化劑溶液(0.25%高碘酸溶液與0.25%偏高碘酸鉀溶液配制而成)，然后加入0.5 mL培養后的待測液，室溫下反應60 min，再加入2 mL的顯色溶液(0.6 mol/L NaOH和0.22 mol/L Na2SO3溶液配制而成)，在380 nm下測定吸光度，每個樣品重復3次。

標準曲線的制作：加已知量的莽草酸到未噴藥前的提取液中，以每25 μL提取液中所含的莽草酸量(mg)為橫坐標，以吸光度為縱坐標，作標準曲線。

式中：C為提取液莽草酸含量(μg/mL)；V為提取液的總體積(mL)；m為樣品質量(g)。

1.3 數據統計分析

將試驗所得的數據通過Excel進行整理，并采用 DPS 7.05 數據統計軟件對試驗數據進行5%差異顯著水平檢測分析。

2 結果與分析

2.1 草甘膦對轉基因大豆的雜草防除效果

應用草甘膦處理過的轉基因大豆雜草防除效果明顯，并且不同劑量處理間差異顯著。根據施藥組與未施藥組的雜草數，可以計算出3組草甘膦處理的株防效與鮮質量防效，由于莖葉處理為大豆三葉期施藥，藥后7 d開始調查，因此莖葉處理的防除效果最為明顯。在2組種子處理中，草甘膦劑量為562.5 g a.i./hm2的處理組防除效果較好，從種子處理后 40 d 開始的株防效為73.25%，直至三葉期后28 d，其株防效仍在50%以上，并且整個測定周期與112.5 g a.i./hm2的低劑量種子處理相比均存在顯著差異(表2)。

表2 轉基因抗草甘膦大豆的株防效和鮮質量防效

注：不同小寫字母表示不同處理相同處理時間在0.05水平上差異顯著。下表同。

2.2 草甘膦對轉基因大豆株高及鮮質量、干質量的影響

在莖葉處理21 d后、種子處理54 d后，草甘膦處理組與對照組的大豆鮮質量、干質量以及株高均無顯著差異(表3)。

2.3 草甘膦對轉基因大豆葉綠素含量及光合速率的影響

由表4可知，應用草甘膦的處理組轉基因大豆葉綠素含量均低于未使用草甘膦的對照組，說明草甘膦的應用對大豆葉綠素含量起到了抑制作用。其中，562.5 g a.i./hm2種子處理組的葉綠素含量在種子處理后40 d時與未施藥組相比顯著降低，在47 d時種子處理組葉綠素含量恢復正常。而莖葉處理方面，葉綠素抑制率在施用后14 d達到最大，隨后草甘膦對葉綠素的抑制作用減弱，從莖葉處理后21 d開始，葉綠素含量恢復正常。

光合速率方面，草甘膦各個處理組的轉基因大豆光合速率均低于未使用草甘膦的對照組，說明草甘膦的應用抑制了大豆光合速率。其中，562.5 g a.i./hm2種子處理組的光合速率在種子處理后40 d時與未施藥組和112.5 g a.i./hm2的低劑量種子處理組相比顯著降低，在47 d時種子處理組光合速率恢復正常。而施用1 125 g a.i./hm2草甘膦的莖葉處理組光合速率抑制率在施用后14 d達到最大，隨后草甘膦對光合速率的抑制作用降低，從莖葉處理后21 d開始光合速率恢復正常。

表3 轉基因抗草甘膦大豆的株高和鮮質量、干質量

表4 轉基因抗草甘膦大豆的葉綠素含量及光合速率

2.4 草甘膦對轉基因大豆莽草酸含量的影響

從表5中可以看出各處理間莽草酸含量差異不顯著，可見應用草甘膦處理的轉基因抗草甘膦大豆莽草酸含量受草甘膦影響不明顯。

3 討論與結論

大豆是我國重要的糧食作物。除草劑的大量使用導致抗藥性雜草出現。長殘留除草劑的使用及除草劑施用前后環境條件的影響也使作物藥害頻發，如在東北地區大豆田，咪唑乙煙酸、氯嘧磺隆等除草劑施用后長期殘留在土壤中，對后茬敏感作物造成嚴重藥害，損失巨大[19]。近年來，轉基因抗除草劑大豆已成為北美和南美洲地區大豆田雜草防除的重要而有效的途徑。已有研究表明，草甘膦在922.5～2 460.0 g a.i./hm2劑量范圍內，對轉基因抗草甘膦大豆的安全性較好[20]。本試驗采用草甘膦種子和莖葉處理對我國目前研發的轉基因大豆呼交06-698的安全性進行了研究，表明草甘膦對該大豆品種安全。

應用草甘膦處理的轉基因大豆田間雜草防除效果顯著，草甘膦種子處理對雜草也有較明顯的防除效果，相對于莖葉處理的優勢在于可在一定時期內明顯控制大豆植株周圍雜草發生，有效降低草甘膦的用量，減少除草劑對農田環境污染，此外采用草甘膦種子處理可以在室內快速測定草甘膦對轉基因抗草甘膦大豆的安全性。

施用草甘膦后，轉基因大豆葉綠素含量、植株生長量、根瘤生物量和根瘤固氮作用均降低[21-23]。草甘膦可抑制葉綠體RNA、 葉綠體核糖體以及色素的形成。葉綠素含量作為植物生理性狀的一個重要指標，反映了光合能力的大小，通過噴施草甘膦后葉綠素變化，可了解草甘膦對光合作用的影響。從試驗結果可以看出，葉綠素含量和光合速率變化趨勢大致相同，表明草甘膦施用后對這2項指標的抑制作用明顯，但隨著時間的延長抑制作用開始降低，草甘膦莖葉處理后28 d、種子處理后61 d葉綠素含量和光合速率恢復到正常水平。植株生長方面，在莖葉處理后21 d、種子處理后54 d，草甘膦處理與對照大豆鮮質量、干質量以及株高均恢復正常水平。

表5 轉基因抗草甘膦大豆的莽草酸含量

草甘膦對植物體內EPSPS有專一抑制作用[24]。通常處理后1 d，莽草酸便開始積累，4～7 d達高峰，測定葉片內莽草酸含量可反映草甘膦所造成的藥害的程度[25]。本研究結果表明草甘膦對中國目前研發的轉基因大豆呼交06-698安全，可用于轉基因抗草甘膦大豆田雜草防除，可通過草甘膦種子處理快速檢測草甘膦對轉基因大豆的安全性。