江蘇省小麥新品系赤霉病抗性鑒定與評價

常 蕾， 張 瑜， 曲若端， 張 勇， 陳懷谷， 馬鴻翔， 張 旭

(1.江蘇省農業科學院糧食作物研究所/江蘇省農業生物學重點實驗室，江蘇南京 210014； 2.江蘇省農業科學院泰州農科所，江蘇泰州 225300；3.江蘇里下河地區農業科學研究所，江蘇揚州 225007； 4.江蘇省農業科學院植物保護研究所，江蘇南京 210014)

小麥赤霉病(Fusarium head blight，簡稱FHB)是一種世界范圍內廣泛流行的小麥病害，包括江蘇省在內的長江中下游冬麥區是小麥赤霉病的多發區和重發區[1]。2012年赤霉病大流行中，山東、河南、安徽和江蘇等地小麥主產區發病嚴重，部分地區產量損失高達301.5～1 877.3 kg/hm2[2]。通過耕作制度和栽培方式的改變難以從根本上消除病害的蔓延和危害。化學藥劑防治的手段不僅會增加農業生產成本，降低小麥生產效益，還會不可避免地造成農業環境污染[3]。因此，尋找小麥赤霉病抗源并進行抗性改良是減輕小麥赤霉病危害最經濟、環保的有效途徑。

多年實踐證明，小麥品種對赤霉病的主要抗性為抗初侵染(resistance to initial infection，簡稱type Ⅰ)、抗擴展(resistance to spread，簡稱type Ⅱ)和抗毒素積累(resistance to toxin accumulation，簡稱type Ⅲ)等多種類型[4-5]。小麥赤霉病抗性評價須在開花至抽穗期進行，表型鑒定不僅易受環境條件影響，而且難以獲得穩定可靠的抗性后代，同時，赤霉病抗性為多基因控制的數量性狀，遺傳機制復雜而不明確，從而進一步制約了小麥赤霉病抗性的遺傳改良。利用分子標記技術能有效克服基因型鑒定的困難，有助于赤霉病抗性的表型鑒定，提高育種效率[6-7]。目前在小麥的21條染色體上均找到了與赤霉病抗性相關的數量性狀基因(quantitative trait locus，簡稱QTL)，其中染色體3BS上的抗擴展QTLFhb1效應較大且穩定，對赤霉病抗性的貢獻最大[8]，側翼緊密連鎖的簡單重復序列(simple sequence repeat，簡稱SSR)標記基因位點Xgwm533和基因診斷型標記基因位點JAAS01可用于該基因的分子標記輔助選擇，已有研究報道赤霉病抗性基因Fhb1被成功轉入小麥感病品系中并提高了該感病品系的抗性[9]。

禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchwabe)是引起小麥赤霉病的主要病原菌，其次生代謝產物如真菌毒素[在我國主要為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，簡稱DON)]還會威脅人類和家畜的健康[10]，成為小麥增產與質量安全的主要威脅，尤其對我國長江流域、黃淮流域等重要冬麥區構成重大威脅[11]。DON毒素積累抗性已成為育種家培育赤霉病抗性品種關注的焦點之一。目前DON的檢測方法主要包括薄層色譜法[12]、高效液相色譜法[13]、氣相色譜法[14]、酶聯免疫檢測法[15](enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)等。酶聯免疫檢測法具有選擇性高、特異性強、靈敏度高、速度快、操作簡單等特點，是目前應用較多的快速檢測DON的方法[16]。

目前，國內所使用的小麥赤霉病抗源往往局限于少數幾個親本，如蘇麥3號、望水白、寧7840等，因而開拓新的抗源已成為當務之急[10]。為了尋找和篩選抗性好的小麥材料，首先應進行小麥種質資源對赤霉病抗性的鑒定和評價。本研究采用單花滴注法對江蘇省各單位提供的97份小麥品系的赤霉病抗性水平進行鑒定，并對其抗擴展性及低毒素積累抗性進行評價，以期全面了解江蘇小麥品種抗赤霉病的現狀水平，為今后更好地進行小麥抗赤霉病育種打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為97份小麥高代品系，由江蘇省各主要育種單位提供(表1)，對照品種蘇麥3號和安農8455由江蘇省農業科學院糧食作物研究所提供。供試菌株為試驗當地強致病力亞細亞鐮刀菌菌株F0609，由江蘇省農業科學院植物保護研究所提供。

表1 江蘇省各育種單位提供的小麥品系

1.2 試驗地點

試驗分別在南京市主城區(江蘇省農業科學院植物保護研究所，南京主城)、南京市六合區(江蘇省農業科學院農業生物技術研究所，南京六合)及揚州市(江蘇里下河地區農業科學研究所，揚州)3地赤霉病病圃內進行。

1.3 赤霉病抗性鑒定與抗病性評價指標

試驗采用完全隨機區組設計，重復3次，每個小區內參試品系按行播種，行長1.5 m，行距25.0 cm，每行播種50～80粒。小麥揚花初期(2015年4月10—22日)，采用單花滴注法將分生孢子液(5×105個/mL)滴注到揚花初期麥穗中部的1個小花中，每品種10穗，塑料袋套袋保濕3 d后，噴水霧3～4次/d，每次5 min左右，以達到保濕效果。

對南京六合病圃及揚州病圃試驗材料進行病小穗數調查：接種后21 d調查接種麥穗的病小穗數。

對南京主城病圃材料進行嚴重度調查：接種后30 d調查病情發生情況，計算平均反應級。分級標準：1級，接種小穗發病，穗軸不發病；2級，穗軸發病，但發病小穗數小于等于全穗的1/4；3級，發病小穗數大于全穗的1/4且小于等于全穗的1/2；4級，發病小穗數占全穗的1/2以上。

抗性分級標準：抗(resistance，簡稱R)，平均病小穗數≤2.00，平均嚴重度<1.40；中抗(moderate resistance，簡稱MR)，2.00<平均病小穗數≤4.00，1.40≤平均嚴重度<2.70；中感(moderate susceptibility，簡稱MS)，4.00<平均病小穗數≤6.00，2.70≤平均嚴重度<3.50；感(susceptibility，簡稱S)，平均病小穗數>6.00，平均嚴重度≥3.50。

1.4 抗性基因標記鑒定

1.4.1 DNA提取與引物的合成 剪取小麥葉片，采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)[17]法提取樣品DNA，采用引物gwm533和JAAS01進行抗性基因鑒定。引物序列為gwm533F：5′-AAGGCGAATCAAACGGAATA-3′，gwm533R：5′-GTTGCTTTAGGGGAAAAGCC-3′；JAAS01F：5′-GTTCC-ACGTCTTCTTACATAATCCC-3′，JAAS01R：5′-TGAAGTTC-ATGCCACGCATA-3′。

1.4.2 SSR檢測 PCR反應體積為10 μL。反應混合液包括10×buffer(含MgCl2)1 μL，10 mmol/L dNTPs 0.8 μL，2.5 μmol/L 引物1.0 μL，50～100 ng模板DNA 3.0 μL，5 U/μLTaq酶0.1 μL，ddH2O補齊。反應程序為94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。gwm533擴增產物經12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色成像；JAAS01擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，熒光染料溴化乙錠染色成像。

1.5 DON含量測定

采用北京華安麥科生物技術有限公司提供的嘔吐毒素(DON)ELISA檢測試劑盒檢測籽粒中的DON含量，檢測方法參照試劑盒說明書。

1.6 數據分析

利用Excel 2007分析標準差與變異系數。

2 結果與分析

2.1 小麥品系的赤霉病抗性鑒定

由表2可知，2014—2015年度，對照蘇麥3號在南京六合、揚州的試驗中病小穗數分別為1.60、1.10，在南京主城區試驗中嚴重度為 1.32，表現為抗赤霉病；安農8455的病小穗數分別為20.00和16.10，嚴重度為3.55，表現為感赤霉病，說明本年度抗性鑒定各點次試驗均為有效試驗。

表2 2014—2015年97份小麥新品系的病情調查

56個淮北品系的病小穗數分布范圍為1.83～19.50，沒有品系達到抗病水平。由表3可知，有2個品系(瑞華14406和淮麥1403)在3地的試驗中均達到中抗(MR)水平，有3個品系(瑞華1408、淮麥12456和淮麥12514)在3地的試驗中均達到中感(MS)及以上水平。41個淮南品系的病小穗數分布范圍為1.00～8.98。由表4可知，其中有15個品系在3地的試驗中均達到中抗(MR)及以上水平。結果表明，淮南小麥品系赤霉病抗性明顯優于淮北小麥品系。

2.2 小麥品系抗性基因的標記診斷鑒定

由表5可知，對97份材料進行赤霉病抗性基因Fhb1的標記診斷鑒定，有6個品系攜有標記JAAS01，且均為淮南品系，其在南京六合和揚州的平均病小穗數分別為3.34、2.12；有19個品系攜有Xgwm533標記，其中17個品系為淮南品系，其在南京六合的平均病小穗數也低于淮南品種平均病小穗數。結果表明，攜有Fhb1抗性位點的小麥品系赤霉病抗性水平明顯提高。

表3 部分淮北小麥品系赤霉病抗性鑒定與評價

2.3 小麥籽粒DON毒素積累抗性檢測

ELISA檢測結果表明，接種赤霉病病菌后淮北小麥品系籽粒的毒素含量范圍為1.32～52.88 μg/g，淮南小麥品系籽粒的毒素含量范圍為 0.70～19.03 μg/g， 淮南小麥品系的低毒素積累抗性明顯優于淮北小麥品系(表2)。所有小麥品系只有15YZSC10的毒素含量達到國家標準(GB 2761—2011《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》)；另有10份小麥品系的籽粒中DON毒素含量低于2.00 μg/g，表明人工接種后江蘇省小麥品系籽粒DON毒素含量較高，低毒素積累抗性較低，低毒素積累抗性是今后江蘇省小麥赤霉病抗性育種所需解決的重點難題。

表4 部分淮南小麥品系赤霉病抗性鑒定與評價

表5 抗性基因Fhb1的標記診斷結果

注：“*”表示供試小麥材料攜帶抗性位點。

3 結論與討論

在已審定的江蘇省小麥品種中，不同麥區的品種赤霉病抗性差異較大，淮北小麥品種多為感病品種，淮南小麥品種多為中抗以上水平。本研究對江蘇省各單位提供的97份小麥新育成品系進行赤霉病抗性鑒定，共發現17個中抗及以上水平的小麥品系，其中品系ZX7007和15YZSC05可作為赤霉病抗性親本應用到育種中。但在赤霉病中抗以上品系中只有2個為淮北品系(瑞華14406和淮麥1403)，其余均為淮南品系，表明淮南小麥品系的赤霉病抗性明顯優于淮北小麥品系，因此提高淮北小麥品種的赤霉病抗性對江蘇省小麥抗赤霉病育種至關重要。

Fhb1是小麥3BS染色體上的抗擴展QTL，對赤霉病的抗性貢獻大。美國已育成一些攜有Fhb1基因的商業軟粒小麥品種[18]。本研究對所有小麥試驗品系進行赤霉病抗性基因Fhb1的JAAS01標記診斷鑒定，發現有6個品系含有Fhb1抗性位點，且赤霉病抗性水平都相對較高，表明Fhb1基因有助于提高小麥赤霉病抗性，今后可以利用分子標記輔助育種技術將該基因轉育至感病的小麥商業化品種中，以提高小麥赤霉病發病率。

研究表明，DON可以干擾核糖體肽基轉移酶的活性，阻礙核糖體循環，抑制蛋白質的合成，引起免疫功能障礙和繁殖功能障礙等癥狀[11]。本研究檢測的97份小麥品系在接種赤霉病菌后，只有11份小麥品系的籽粒中DON毒素含量低于2 μg/g，表明江蘇省小麥籽粒DON毒素含量較高。目前尚沒有單一措施可以徹底解決鐮刀菌毒素的污染難題。赤霉病的綜合治理技術包括選擇抗病品種、殺菌劑噴霧、作物輪作以及耕翻等。因此，培育抗赤霉病、籽粒低DON含量的品種是控制赤霉病、減輕DON危害最為經濟有效且對環境友好的途徑。