干旱脅迫下3種類型新疆野核桃保護酶和丙二醛含量的變化

余 甜， 張 萍， 陳韋多

(新疆農業大學林學與園藝學院/新疆教育廳干旱區林業生態與產業技術重點實驗室，新疆烏魯木齊 830052)

世界上有1/3以上的土地處于干旱、半干旱地區，而非干旱地區在植物生長季節也常發生不同程度的干旱[1]，干旱已成為世界范圍內影響農業生產的主要現象之一。目前，對植物耐旱機制的研究日益受到重視，且多集中在干旱脅迫時植物的生理生化反應及相應的適應性機制[2-3]。在長期進化過程中，植物形成保護系統以清除活性氧，減輕或避免活性氧對細胞造成的傷害，而抗氧化酶系的表達和滲透調節物質的積累提高了植物的抗逆性，最終體現為植物對干旱脅迫的抗性[4-5]。

新疆野核桃(Juqlans regia)屬胡桃科、胡桃屬植物，既是珍稀野生林木資源，又是世界上稀有的野生核桃資源，中國僅在新疆維吾爾自治區伊犁鞏留縣野核桃溝有成片分布，并經考證認為是栽培核桃的直系祖先[6-7]，按種子特征主要劃分為14個類型[8]。有研究發現，影響新疆野核桃生長繁衍的限制因素主要是生境溫度和濕度[9-10]。本試驗以卵圓形、尖嘴形、心形3種類型新疆野核桃為研究對象，測定干旱脅迫下新疆野核桃苗期葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量，初步比較3種新疆野核桃在干旱脅迫下的生理反應差異，確定其適生水分范圍，為新疆野核桃的進一步保護性開發研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗處理

采集種子表型特征差異明顯，在新疆野核桃溝存活株數較多，且在各生長區域有一定數量分布的卵圓形、尖嘴形、心形3種類型新疆野核桃種子，單株取樣，按不同類型混合；當年11月播種于花盆內，并在位于新疆烏魯木齊縣水西溝的陽光溫室內培養；次年7月，每個類型隨機選取50株盆栽1年生新疆野核桃實生幼苗，在新疆農業大學林木遺傳育種實驗室內進行持續自然干旱處理，處理前澆足量水，使每株幼苗土壤水分達到相對飽和狀態，后直到試驗結束不再澆水；每隔 5d，即分別在試驗后0(剛灌完水，CK)、5、10、15、20、25d及復水10d，于08：00隨機選取新疆野核桃實生幼苗中上部的成熟葉片，測定葉片的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性及丙二醛含量等指標。

1.2 各指標的測定方法

1.2.1CAT活性 參照鄒琦的方法[11]進行：新疆野核桃幼苗葉片提取酶液0.05mL，加入1.5mL磷酸緩沖液，再加 1mL蒸餾水；逐管加入0.1mol/LH2O20.45mL，迅速倒入石英杯中，測定波長為240nm處的吸光度，每隔1min讀數1次，共讀數5次；計算CAT活性，公式為：

CAT活性=(D240 nm×VT)/(0.1×V1×t×m)。

式中：D240 nm為波長240nm的吸光度；VT為提取酶粗液的總體積，mL；V1為測定時用的酶體積，mL；t為開始加H2O2到最后1次的讀數時間，min；m為葉片鮮質量，g。

1.2.2POD活性 參照李合生等的方法[12]進行：試管中依次加入磷酸緩沖液2mL、2%H2O20.2mL、愈創木酚 0.5mL，最后加入新疆野核桃幼苗葉片提取酶液0.1mL，水浴鍋中34 ℃保溫1min；取出，測定波長為470nm處的吸光度，每隔0.5min讀數1次，共讀數5次；計算POD活性，公式為：

POD活性=(ΔD470 nm×VT)/(0.01×VS×t×m)。

式中：ΔD470 nm為反應時間內吸光度的變化；VT為總提取液體積，mL；m為葉片鮮質量，g；VS為測定時使用的酶液體積，mL；t為反應時間，min。

1.2.3SOD活性 參照李合生等的方法[12]進行：試管中依次加入磷酸緩沖液1.5mL、甲硫氨酸(Met)0.3mL、氮藍四唑(NBT)0.3mL、乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Na2)0.3mL、0.25mL蒸餾水、稀釋5倍的核黃素0.3mL，最后加入新疆野核桃幼苗葉片提取酶液0.05mL，置于4 000lx日光下反應 6min，以暗處理的樣品為空白對照，測定波長為560nm處的吸光度，計算SOD活性，公式為：

SOD活性=(D0-Ds)×VT/(0.5×D0×V1×t×m)。

式中：D0為空白對照的吸光度；Ds為樣品管的吸光度值；VT為樣品液的總體積，mL；m為樣品鮮質量，g；V1為測定時提取液用量，mL；t為反應時間，min。

1.2.4MDA含量 稱取樣品2g，加入10%三氯乙酸2mL，研磨至勻漿，再加入10%三氯乙酸8mL進一步研磨，勻漿 4 000r/min離心10min；吸取上清液2mL，加入0.6%硫代巴比妥酸溶液2mL，以加入2mL蒸餾水為對照，混勻，沸水浴反應15min；迅速冷卻，離心，取上清液，分別測定波長為532、600、450nm處的吸光度，計算MDA含量，公式為：

MDA含量=[6.45×(D532 nm-D600 nm)-0.56×D450 nm]×V/m。

式中：D532nm、D600 nm、D450 nm分別為波長532、600、450nm處的吸光度；V為樣品液的總體積，mL；m為樣品鮮質量，g。

1.3 統計分析

采用Excel2010、SPSS19.0軟件對數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下新疆野核桃葉片CAT活性的變化

由表1可知，干旱脅迫處理0～10d，3種類型新疆野核桃葉片CAT活性增長較為緩慢；脅迫處理10～20d，3種類型新疆野核桃葉片CAT活性增長較為迅速；脅迫處理20d時，卵圓形、尖嘴形、心形野核桃的CAT活性分別為235.33、151.66、131.00U/(g·min)，其中卵圓形野核桃的CAT活性顯著高于其他2個類型野核桃(P<0.05)；卵圓形、尖嘴形野核桃葉片的CAT活性在脅迫處理20d時達到最大值，脅迫處理25d時急劇下降，而心形野核桃在脅迫處理25d時達到最大值，為170.66U/(g·min)，心形野核桃的CAT反應受干旱脅迫時間相比前兩者較長；復水10d，尖嘴形、卵圓形野核桃葉片的CAT活性分別為52.00、34.66U/(g·min)。

表1 干旱脅迫下3種類型新疆野核桃葉片的CAT活性

注：數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.2 干旱脅迫下新疆野核桃葉片POD活性的變化

由表2可知，干旱脅迫處理0～5 d，3種類型新疆野核桃葉片的POD活性變化不大，在50 U/(g·min)左右，呈緩慢上升趨勢；脅迫處理5～20 d，3種類型野核桃葉片的POD活性急劇上升，其中心形野核桃葉片POD活性增長幅度相對最大，其次是卵圓形，尖嘴形野核桃葉片POD活性增長相對最慢；脅迫處理20 d時，3種類型野核桃葉片POD活性相互間有顯著性差異(P<0.05)；脅迫處理20～25 d，心形野核桃葉片POD活性依然呈增長趨勢，且在脅迫處理25 d時達到峰值，為222.80 U/(g·min)，而卵圓形和尖嘴形野核桃葉片POD活性均呈下降趨勢；脅迫處理25 d時，卵圓形野核桃葉片的POD活性降到2.00 U/(g·min)；心形野核桃葉片POD活性在復水10 d時相對最低，為7.40 U/(g·min)。

表2 干旱脅迫下3種類型新疆野核桃葉片的POD活性

2.3 干旱脅迫下新疆野核桃葉片SOD活性的變化

SOD是一種重要的活性氧清除酶，當外來脅迫導致活性氧大量產生時，SOD能及時有效清除自由基，保護細胞免受活性氧脅迫的傷害[13]。由表3可知，干旱脅迫處理0～10 d，尖嘴形、心形野核桃葉片的SOD活性增加速度相對較慢，而卵圓形野核桃葉片的SOD活性增長速度相對較快；脅迫處理5 d時，卵圓形野核桃葉片SOD活性顯著低于其他2種類型(P<0.05)；脅迫處理10～20 d，卵圓形和尖嘴形野核桃葉片的SOD活性增長非常接近，有幾乎相同的變化趨勢，而心形野核桃葉片的SOD活性增長速度稍為緩慢；卵圓形野核桃葉片的SOD活性在脅迫處理20 d時達到峰值，而其他2種類型野核桃在脅迫處理25 d時達到峰值；復水10 d，卵圓形、尖嘴形野核桃葉片的SOD活性有明顯的下降。

表3 干旱脅迫下3種類型新疆野核桃葉片的SOD活性

2.4 干旱脅迫下新疆野核桃葉片丙二醛含量的變化

植物體內的膜脂過氧化產物積累與植物受逆境傷害程度呈正比關系，植物受傷害程度越小，則丙二醛積累量越小；反之，則丙二醛含量越大[14]。由表4可知，隨脅迫天數的增加，卵圓形、尖嘴形野核桃葉片的丙二醛含量呈先上升后下降趨勢，而心形野核桃葉片丙二醛含量呈持續上升趨勢；干旱脅迫處理15～20 d，卵圓形、尖嘴形野核桃葉片的丙二醛含量呈明顯上升趨勢，且在脅迫處理20 d時達到峰值；心形野核桃葉片丙二醛含量在脅迫處理25 d時達到峰值，為 26.66 μmol/g，與其他2個類型野核桃葉片丙二醛含量相比有顯著性差異(P<0.05)；復水10 d，3種類型野核桃葉片的丙二醛含量都有不同程度的下降。

表4 干旱脅迫下3種類型新疆野核桃葉片的MDA含量

3 結論與討論

野生植物資源是重要的遺傳資源，是未來人類能夠利用的資源[8]。新疆野核桃在我國主要分布于新疆維吾爾自治區伊犁鞏留野核桃溝內，是極為珍稀的野生資源，對育種和栽培核桃的起源、演化研究具有重要的價值。王肇延研究表明，新疆野核桃對生存的環境要求較高，而新疆氣候干燥、降水量少的特點時刻威脅著新疆各類野生果樹的生存[10]。因此，研究新疆野核桃在干旱環境下的生理適應性反應，對新疆野核桃未來的研究利用有著重大意義。

植物保護酶系統主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等，相互間可協同作用，使氧自由基維持在一個較低的水平上，從而防止氧自由基對生物體造成傷害，目前已廣泛用于植物對逆境的反應機制研究[15]。過氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中，是生物防御體系的關鍵酶之一，其活性與植物的代謝強度及抗寒、抗病能力有一定關系；過氧化物酶是植物體中活性較高的一種酶，與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關系，可作為組織老化的一種生理指標。超氧化物歧化酶是一種能夠催化超氧化物通過歧化反應轉化為氧氣和過氧化氫的酶[16]，是生物體內一種很重要的抗氧化酶類，有很好的科研意義和應用價值[17]。試驗結果表明，卵圓形、尖嘴形2種類型的新疆野核桃葉片CAT活性在干旱脅迫處理20 d時達到最大值，后開始下降，心形新疆野核桃葉片CAT活性在干旱脅迫處理25 d時達到最大值，說明心形野核桃抗旱能力較強；3種類型新疆野核桃葉片POD活性在脅迫初期呈緩慢增長趨勢，說明植物對干旱脅迫有一個適應調節的過程，而其變化幅度大小說明植物調節能力的強弱；脅迫處理25 d至復水10 d，卵圓形野核桃葉片的POD活性繼續上升，說明干旱脅迫程度已達到飽和，POD活性不再發揮作用；干旱脅迫初期，卵圓形野核桃葉片的SOD活性增加速度相對較快，其余兩者增長速度較慢，植株通過體內SOD活性上升來抵御逆境，使植物不受或受到較小傷害；干旱脅迫期間，尖嘴形、心形新疆野核桃葉片SOD活性呈持續上升狀態，表明這2種新疆野核桃有較強的抗旱性。

丙二醛是機體內脂質過氧化的最終產物之一，其含量高低可一定程度上反映植物受氧化傷害的程度[18-19]。本試驗結果表明，干旱脅迫過程中，心形野核桃葉片的丙二醛含量呈上升趨勢，直至復水10 d下降，而卵圓形、尖嘴形野核桃葉片的丙二醛含量呈先上升后下降趨勢，脅迫處理20 d時達到峰值，說明心形野核桃的抗逆性較尖嘴形、卵圓形抗逆性強。

從整體來看，心形野核桃過氧化過程相對較慢，細胞膜穩定性較高，抗旱性較強，尖嘴形野核桃調節自身抗氧化酶活性的能力居中，而卵圓形野核桃參與滲透調節能力消耗相對較大，調節自身抗氧化能力相對較弱；3種野核桃抗旱性強弱依次為心形>尖嘴形>卵圓形。