拮抗凡隆氣單胞菌的海洋芽孢桿菌chenj-1的分離與鑒定

陳 靜， 夏艷秋， 顧冬瑩， 朱 強

(江蘇省海洋生物技術重點實驗室/淮海工學院海洋生命與水產學院，江蘇連云港 222005)

芽孢桿菌被認為兼有改善水生動物消化道和改良水環境的雙重功效，作為益生菌在水產養殖上有著重要用途。目前，在水產養殖中應用得較多的芽孢菌主要有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等。芽孢菌在生長過程中產生大量的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等水解酶系，幫助機體消化、吸收飼料，降低飼料系數；產生B族維生素及維生素C，有助于提高機體的免疫活性；同時代謝產生乙酸、丙酸、丁酸等揮發性脂肪酸，可降低消化道內pH值和氨的濃度，維持機體的內環境，起到防病、抗菌的雙重作用。

凡隆氣單胞菌在醫學上稱維羅納氣單胞菌、維隆氣單胞菌，獸醫上常譯作凡隆氣單胞菌[1]，是近些年確定的氣單胞菌科的新種，能引起人的局部和系統感染[2]，同時在水產養殖上也逐漸成為危害性較大的病原菌。如該菌曾引發孟加拉國魚類的流行性潰瘍綜合征[3]。在國內，該菌感染能使丁、羅非魚、中華絨螯蟹、泥鰍、甌江彩鯉等水產動物患病[4-8]，給養殖業帶來較大的經濟損失。目前，氣單胞菌病的水產防治主要是靠水體消毒和內服有效抗生素。抗生素濫用帶來的耐藥菌產生存在公共安全衛生隱患。所以，尋找綠色安全漁藥成為當前的重點。本研究通過拮抗試驗來篩選對凡隆氣單胞菌有抑制作用的菌株并對其抑制特性進行研究，為開發水產微生物活性制劑提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

出發菌株：由筆者所在課題組分離自連云港海域海泥樣品中，共36株。

指示靶病原菌：凡隆氣單胞菌溫和生物型(Aeromonasveroniibiovar.sobria)NQ菌株(由淮海工學院秦蕾博士分離自發病泥鰍，人工感染試驗證實為泥鰍發病的致病源)。

1.2 培養基

TSB培養基：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，K2HPO42.5 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

TSA培養基：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂粉15.0～20.0 g，K2HPO42.5 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 出發菌株對凡隆氣單胞菌NQ拮抗試驗 初篩：將凡隆氣單胞菌NQ接種至TSB液體培養基中，于28 ℃、160 r/min 搖床培養24 h，取100 μL涂布在TSB固體平板上，然后將出發菌株點種到涂布好的TSB固體平板上，28 ℃培養48 h，觀察拮抗效果及測量抑菌圈直徑。復篩：將出發菌株接種于TSB培養基搖瓶發酵，將發酵液離心，取上清液用 0.22 μm 無菌濾膜過濾，在置于涂布凡隆氣單胞菌的TSA平板上的牛津杯中加入50 μL上述濾液。于28 ℃培養一定時間后，測量發酵液的抑菌圈直徑。

1.3.2 菌株的分類鑒定

1.3.2.1 形態特征 參照文獻[9]，將菌株接種到TSA平板，于28 ℃培養24 h，觀察菌落形態及細胞形態。細胞形態采用革蘭氏染色和簡單染色進行觀察，并進行芽孢染色和鞭毛染色觀察。

1.3.2.2 菌體的生理生化反應研究 采用細菌微量生化反應管鑒定。按照操作說明在細菌微量生化反應管中接入 50 μL 對數期菌株培養懸液，置于28 ℃恒溫培養箱培養，18～24 h后觀察并記錄結果。

1.3.2.3 細菌的16S rDNA PCR擴增與測序

1.3.2.3.1 細菌DNA提取 (1)取菌株過夜培養液1.5 mL于EP管中，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液。(2)加 567 μL TE緩沖液，用定量移液器吹打懸浮沉淀，并加30 μL 10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，15 μL 20 mg/mL蛋白酶K，混勻，37 ℃保溫1 h。(3)加100 μL 5 mol/L NaCl，充分混勻；再加80 μL CTAB/NaCl溶液，混勻；65 ℃保溫10 min。(4)用等體積酚 ∶氯仿 ∶異戊醇(25 ∶24 ∶1)抽提，離心4～5 min，將上清液移至干凈EP管。(5)加0.6～0.8倍體積的異丙醇，顛倒混合，冰箱冷凍層靜置15 min，沉淀DNA。(6)12 000 r/min 離心10 min使DNA沉淀，加40-TE溶解，-20 ℃ 保存。作為PCR模板。

1.3.2.3.2 PCR擴增 引物設計[10]：16S rDNA正向引物為(ALF165312)：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，16S rRNA的通用引物(反向引物：ALF165313)：5′-CGGCTACCT-TGTTACGAC -3′，以上引物均由上海生工生物工程服務有限公司合成。

基因PCR擴增：50 μL PCR反應體系：基因組DNA模板2 μL，10×PCR buffer 5 μL，10 mmol/L MgCl24 μL，2.5 μmol/L dNTP 0.5 μL，2.5 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL，5 U/μLTaqTMDNA聚合酶(TaKaRa)0.5 μL，最后加無菌雙蒸水至50 μL，混合。PCR反應程序：95 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統檢查并拍照。PCR產物純化后，送上海生工生物工程技術服務公司測序。

1.3.2.5 序列比對與系統發育分析 將所測定的16S rDNA序列通過NCBI-NLM中Nucleotide-nucleotide Blast程序與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數據庫中核苷酸序列進行同源性分析[11]，并通過數據庫下載與試驗菌株親緣關系較近并已經確證的序列，用Clustal X軟件進行多序列比對，采用MEGA 4軟件的鄰接法進行系統發育分析，并構建系統進化樹。

1.3.3 菌株生長曲線以及不同時間段發酵產物抑菌活性的研究 將菌株培養過夜搖瓶作為種子液以3%接種量接種大搖瓶28 ℃、160 r/min搖床培養，分別取不同時間培養液測定D600 nm值和用雙層平板牛津杯法測定發酵離心清液的抑菌圈大小，繪出生長曲線和不同發酵時間抑菌圈大小。

2 結果與分析

2.1 凡隆氣單胞菌拮抗分離、篩選

通過對36株出發菌株初篩和復篩試驗，得到1株對凡隆氣單胞菌(Aeromonasveronii)NQ拮抗活性明顯的菌株 chenj-1。由表1、圖1可知，菌株chenj-1對凡隆氣單胞菌具有較強的拮抗作用，并且可知其主要拮抗物質為胞外產物。

表1 chenj-1菌株對凡隆氣單胞菌的拮抗效果

2.2 菌株的分類鑒定

2.2.1 形態特征 菌株chenj-1在TSB培養基上呈淡黃色菌落，表面粗糙，邊緣不整齊。由圖2可知，菌株chenj-1革蘭氏染色呈陽性，短桿狀、兩端鈍圓，多單個或成對出現，有芽孢，芽孢囊稍有膨大、呈橢圓形，中生到次端生，有稀疏的周生鞭毛。根據形態特征初步判斷菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

2.3 菌株的生理生化鑒定

根據表2、圖2，結合生理生化鑒定和細胞形態學分析，并參照《伯杰細菌鑒定手冊》[12]及常見細菌系統鑒定手冊[9]對菌株chenj-1初步歸類為革蘭氏陽性芽孢桿菌屬。

表2 菌株chenj-1生理生化反應

2.4 菌株chenj-1 16S rDNA序列分析

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，由凝膠成像系統下顯示的圖像可知，引物擴增出的序列長度約為1.5 kb(圖3)，符合常規的16S rDNA序列長度。

經測序，菌株chenj-1 16S rDNA核苷酸序列大小為 1 398 bp，其序列已在GenBank中登記，登記號為JN051503。經與GenBank數據庫中報道的16S rDNA核苷酸序列比對，選取芽孢桿菌屬各種的16S rDNA核苷酸序列與菌株的16S rDNA核苷酸序列構建系統發育樹。由圖4可知，菌株與B.amyloliquefacien(X60605、AY608741、AY603658、DQ993675)位于同一簇群，親緣關系最近。根據菌株的形態特征、生理生化試驗、16S rDNA核苷酸序列分析及系統發育分析，將菌株初步鑒定為海洋解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

2.5 菌株chenj -1生長曲線及不同發酵時間抑菌活性

將菌株chenj -1培養過夜搖瓶作為種子液以3%接種量接種大搖瓶發酵培養(28 ℃，160 r/min)，分別取不同時間發酵液測定D600 nm值和用雙層平板牛津杯法測定發酵離心上清液的抑菌圈大小，繪出生長曲線和不同發酵時間抑菌圈大小。

由圖5可知，菌株chenj-1生物量在20 h后進入穩定期，28 h發酵上清液的抑菌活性最高，抑菌圈直徑為 15.8 mm，說明抑菌活性物質在穩定期大量產生并在穩定中后期積累，對于擴大生產具有指導意義。

3 結論與討論

芽孢桿菌屬被認為是一類產生多種抗微生物活性物質的微生物[13-14]，而解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一員，也有不少文獻展示其在抑制病原微生物方面的活性，楊勝遠等獲得1株解淀粉芽孢桿菌K6菌株有廣譜抗菌活性，包括對細菌、酵母、霉菌和白色念珠菌都具有抑制作用[15]，Lim等從解淀粉芽孢桿菌RX7菌株分離了1種廣譜拮抗多種病原細菌和白色念珠菌的細菌素[16]；而Seung等、Alvindia等和Calvo等分別獲得具有控制植物真菌性病原微生物的解淀粉芽孢桿菌菌株CNU114001、DGA14、BUZ-1[17-19]。

本試驗采集江蘇省連云港及附近海域海泥、海水及海洋生物樣品，分離得到36株海洋芽孢桿菌并從中篩選到1株強拮抗凡隆氣單胞菌的菌株chenj -1。通過形態學、生理生化(包括耐鹽性)試驗及16S rDNA基因比對初步歸類為海洋解淀粉芽孢桿菌。在對菌株chenj -1生長曲線及其不同時間段發酵代謝產物的抑菌活性初步研究發現，菌株生物量與代謝活性產物量呈正相關，生物量在20 h達到最大值并進入平衡期， 28 h發酵液抑菌圈直徑最大(15.8 mm)。試驗結果為生物防治由凡隆氣單胞菌引起的水產動物疾病提供了理論依據。經初步試驗，B.amyloliquefacienchenj-1其硫酸銨鹽析產物抑菌活性有所提高，但具體活性物質的結構和組分需要進一步研究。