檢測低濃度布魯氏菌抗體的阻抗型免疫傳感器構(gòu)建

楊 威， 韓小平， 宋海燕， 張志勇， 馮俊惠， 左月明

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，山西太谷 080801)

布魯氏菌病(簡稱布病)是由布魯氏菌感染引起的人畜共患性傳染病[1-2]，該病常給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測技術(shù)無法對(duì)低濃度的布魯氏菌抗體進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測。因此，本研究利用電化學(xué)免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、分析速度快、設(shè)備簡單等特點(diǎn)，結(jié)合血清學(xué)檢測方法，旨在研制能夠快速、準(zhǔn)確地檢測低濃度布魯氏菌病抗體的免疫傳感器，為及早發(fā)現(xiàn)布病、減輕布病對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康的威脅提供技術(shù)支持。

電化學(xué)阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy，簡稱EIS)是電化學(xué)暫態(tài)技術(shù)，是以微小振幅的正弦波為擾動(dòng)信號(hào)的電化學(xué)測量方法[3]，通過記錄載體表面的電容和界面的電子轉(zhuǎn)移阻抗等參數(shù)的變化來分析生物分子在載體表面的固定情況，以獲得更多關(guān)于體系的信息，提供評(píng)價(jià)分析生物學(xué)體系的電化學(xué)手段。例如，平倩倩構(gòu)建了分子印記傳感器，通過交流阻抗譜法對(duì)大腸桿菌進(jìn)行特異性檢測[4]。許麗等設(shè)計(jì)了檢測大腸桿菌數(shù)量的電化學(xué)阻抗傳感器[5]。Santos等用EIS方法構(gòu)建了檢測大腸桿菌的傳感器[6]。由相關(guān)研究可知，電化學(xué)阻抗譜技術(shù)在免疫復(fù)合物的檢測上已有很好的應(yīng)用，在頻率域上用電化學(xué)阻抗譜定量檢測抗體可以獲得更全面的信息。本試驗(yàn)在有氧化還原對(duì){[Fe(CN)6]3-/4-}存在的情況下進(jìn)行測試，通過表征電極界面的性質(zhì)來檢測抗原抗體復(fù)合物[7]，構(gòu)建阻抗型免疫傳感器，為低濃度布魯氏菌抗體定量檢測的深入研究奠定良好基礎(chǔ)。本試驗(yàn)于2014年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物電子與傳感器實(shí)驗(yàn)室完成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要試驗(yàn)材料為由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗原和布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(抗體)；主要試劑有羅氏公司提供的牛血清白蛋白；其他試劑有亞鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鐵氰化鉀、氯化鉀、磷酸二氫鈉等。所有試劑均為分析純。

1.2 溶液配制

磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution，簡稱PBS)的配制：稱取適量磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，溶入超純水配成 10 mmol/L 溶液后，加入0.9%氯化鈉，然后將溶液的pH值調(diào)至7.4，經(jīng)高溫高壓滅菌后，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

電解液的配制：將0.823 1 g鐵氰化鉀、1.056 1 g亞鐵氰化鉀和0.745 5 g氯化鉀溶入PBS中，定容到100 mL，即配制成5 mmol/L支持電解液。

牛血清白蛋白溶液(bovine serum albumin，簡稱BSA)：1% BSA，配制方法為將25% BSA溶于適量PBS中，使用時(shí)配制。

1.3 布魯氏菌抗原、抗體溶液的準(zhǔn)備

布魯氏菌抗原用PBS稀釋成濃度為4×109CFU/mL的抗原溶液。布魯氏菌抗體按10倍梯度稀釋成濃度為1×10-4～1 IU/mL的5個(gè)濃度梯度的抗體溶液。

1.4 免疫電極的制備

絲網(wǎng)印刷金電極用水潤洗，在工作電極上滴涂10 μL抗原溶液，于37 ℃恒溫、恒濕盒中放置1 h，取出后重復(fù)清洗2次。然后用牛血清白蛋白溶液封閉未反應(yīng)的非特異性位點(diǎn)[8]，于37 ℃恒溫、恒濕盒中靜置1 h，再充分清洗，除去未結(jié)合的牛血清白蛋白。

1.5 免疫傳感器的檢測方法

本試驗(yàn)采用同一電極依次修飾不同濃度梯度抗體的方法[9]。在電化學(xué)阻抗譜的初始電位為0.13 V、頻率范圍為 0.1～100 000 Hz、交流擾動(dòng)信號(hào)幅值為0.005 V的條件下進(jìn)行測試。測試液為電解液，全部試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)主要用Origin 8.5軟件和Zsimpwin軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始電位及頻率范圍的選擇

在進(jìn)行交流阻抗測試時(shí)，初始電位的選擇會(huì)影響交流阻抗譜曲線的變化。本試驗(yàn)以絲網(wǎng)印刷金電極-抗原-BSA-抗體(即在絲網(wǎng)印刷金電極上修飾抗原，然后用BSA封閉，再綁定抗體進(jìn)行測試)電極作為工作電極，通過改變參數(shù)確定合適的初始電位。分別選擇 0.13、0.22 V作為考察電位。如圖1所示，該曲線包括2個(gè)部分，即接近半圓的部分和直線部分，分別對(duì)應(yīng)電子傳遞過程和擴(kuò)散過程。當(dāng)設(shè)置電位為0.13 V 時(shí)，曲線接近半圓的部分直徑最小，接近開路電位，測試對(duì)傳感器體系的影響最小，更利于反映傳感器的真實(shí)性質(zhì)。通常當(dāng)測試頻率小于0.001 Hz時(shí)，EIS為電解質(zhì)的導(dǎo)電率，當(dāng)測試頻率大于100 kHz時(shí)，體系內(nèi)的感抗值發(fā)生變化[10]。因此，選擇初始電位為0.13 V，工作頻率范圍為0.1～100 000 Hz。

2.2 免疫傳感器的Bode圖分析

Bode圖用于描述電化學(xué)體系中阻抗模的對(duì)數(shù)(lgZ)和相位角與頻率對(duì)數(shù)(lgFreq)的關(guān)系。在Nyquist圖中，頻率值是隱含的，尤其在高頻區(qū)，要標(biāo)出每個(gè)點(diǎn)的頻率比較困難，而Bode圖可獲得傳感器體系對(duì)頻率響應(yīng)的相關(guān)信息，是表示EIS測試結(jié)果更有效的方法[11]。

在本研究中，當(dāng)用免疫傳感器測試不同濃度的抗體后，在Bode圖譜中布魯氏菌抗體的阻抗值對(duì)數(shù)隨頻率對(duì)數(shù)的變化規(guī)律如圖2-a所示，可以看出，當(dāng)lgFreq值在-1.0～1.0之間的低頻段時(shí)，阻抗模的對(duì)數(shù)值隨著布魯氏菌抗體濃度由低到高變化，其值由小到大依次為1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1 IU/mL。如圖2-b所示，當(dāng)lgFreq值在 -1.0～1.0之間的低頻段時(shí)，布魯氏菌抗體的相位角隨頻率對(duì)數(shù)由小到大變化，按照布魯氏菌抗體濃度值由低到高排列，該曲線能夠反映免疫傳感器的電阻和電容的綜合特性。

阻抗的實(shí)部、虛部對(duì)數(shù)值與頻率對(duì)數(shù)的關(guān)系如圖3所示，可以看出，在坐標(biāo)系下部，當(dāng)lgFreq值為0.6～1.6時(shí)，隨著頻率對(duì)數(shù)的增大，阻抗的虛部對(duì)數(shù)值逐漸增大，與布魯氏菌抗體濃度呈正比關(guān)系。在坐標(biāo)系上部，當(dāng)lgFreq值為-1～1時(shí)，隨著頻率對(duì)數(shù)值增大，阻抗的實(shí)部對(duì)數(shù)值逐漸減小，與布魯氏菌抗體濃度呈反比關(guān)系。免疫傳感器通過實(shí)部、虛部與頻率對(duì)數(shù)的關(guān)系曲線，能夠定性判斷布魯氏菌抗體濃度的變化規(guī)律。

2.3 免疫傳感器的交流阻抗特性

在上述確定的試驗(yàn)條件下，將電極置于50 μL電解液中測試免疫傳感器的響應(yīng)。用制備的免疫傳感器對(duì)濃度為1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1 IU/mL的布魯氏菌抗體溶液進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜測試，當(dāng)測試信號(hào)通過免疫傳感器時(shí)，吸附到電極表面的免疫復(fù)合物會(huì)明顯地增大電極-溶液界面的阻抗[12]，出現(xiàn)濃差極化和電化學(xué)極化，這時(shí)電極的法拉第阻抗在高頻部分為雙電層的容抗弧，而在低頻部分，擴(kuò)散控制將超過電化學(xué)控制，出現(xiàn)向右上方傾斜的直線，如圖4所示。當(dāng)用免疫電極測試不同濃度的抗體時(shí)，電子轉(zhuǎn)移阻抗明顯增大，說明免疫傳感器上固定的布魯氏菌抗原與抗體發(fā)生了免疫反應(yīng)，并已結(jié)合到電極表面形成免疫復(fù)合物，阻礙了氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面的傳遞，使其難以通過電極表面獲得電子。隨著免疫傳感器結(jié)合抗體濃度的逐步增加，電極表面的膜逐漸增厚， 圖4中半圓形的直徑隨著布魯氏菌抗體濃度的增大而增大。

2.4 免疫傳感器的等效電路模型

試驗(yàn)后對(duì)測試數(shù)據(jù)通過Zsimpwin軟件擬合，以此來模擬和推測電極界面所發(fā)生的物理化學(xué)過程，判斷電極的表面狀況。為了更好地分析本試驗(yàn)的電化學(xué)體系，獲得電極表面動(dòng)力學(xué)和擴(kuò)散特征的相關(guān)參數(shù)，建立Randles模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合[13]。

將免疫傳感器置于含有氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-的環(huán)境中，根據(jù)電化學(xué)阻抗譜測試后的數(shù)據(jù)建立等效電路，有助于對(duì)免疫傳感器系統(tǒng)測試結(jié)果中各組成部分作進(jìn)一步探討，利用Zsimpwin軟件對(duì)電化學(xué)阻抗譜進(jìn)行分析，探討電極界面的機(jī)制。在電化學(xué)極化和濃差極化同時(shí)存在的情況下，擬合的等效電路如圖5所示?？梢钥闯?，當(dāng)發(fā)生極化時(shí)，由于界面濃度周期性變化產(chǎn)生了反映溶液中氧化還原探針擴(kuò)散特性的Warburg阻抗。常相位角元件和電子轉(zhuǎn)移阻抗受到電極-電解質(zhì)界面的介電特性和絕緣特性影響[14]。

筆者通過Zsimpwin軟件擬合每個(gè)濃度抗體測試后的阻抗數(shù)據(jù)。當(dāng)抗體溶液的濃度為1×10-4～1 IU/mL時(shí)，等效電路中的Rs為(17.44+0.67)Ω，相對(duì)誤差為3.85%，說明Rs不受免疫傳感器表面復(fù)合物的影響。

由表1中的數(shù)據(jù)可知，免疫傳感器上結(jié)合抗體后電極的電子轉(zhuǎn)移阻抗發(fā)生了明顯的變化。由于抗原抗體形成非導(dǎo)電免疫復(fù)合物，電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化值(ΔRct=Rct(Ab)-Rct(BSA))隨著抗體濃度的增加而逐漸增大。擬合曲線方程為y=288.83 lgC+1 556.11，相關(guān)系數(shù)為0.972 4。

表1 抗體濃度與電子轉(zhuǎn)移阻抗變化值的關(guān)系

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用電化學(xué)阻抗譜測試技術(shù)實(shí)現(xiàn)了布魯氏菌抗體的定量檢測。通過Zsimpwin軟件對(duì)測試后的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，提出了免疫傳感器系統(tǒng)的等效電路，得到該體系的4個(gè)組成部分，即電解液電阻、常相位角元件、電子轉(zhuǎn)移阻抗和Warburg阻抗。在所有參數(shù)中電子轉(zhuǎn)移阻抗改變量最大，當(dāng)布魯氏菌抗體溶液濃度在1×10-4～1 IU/mL范圍時(shí)，Ret的變化值與布魯氏菌抗體溶液濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.972 4。與其他測試方法相比，電化學(xué)阻抗譜以小振幅的正弦波信號(hào)對(duì)體系進(jìn)行擾動(dòng)，避免對(duì)體系產(chǎn)生大的影響，簡化了測試數(shù)據(jù)的處理過程。