檢測低濃度布魯氏菌抗體的阻抗型免疫傳感器構建

楊 威， 韓小平， 宋海燕， 張志勇， 馮俊惠， 左月明

(山西農業大學工學院，山西太谷 080801)

布魯氏菌病(簡稱布病)是由布魯氏菌感染引起的人畜共患性傳染病[1-2]，該病常給農業生產帶來巨大損失。傳統的血清學檢測技術無法對低濃度的布魯氏菌抗體進行快速、準確的檢測。因此，本研究利用電化學免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、分析速度快、設備簡單等特點，結合血清學檢測方法，旨在研制能夠快速、準確地檢測低濃度布魯氏菌病抗體的免疫傳感器，為及早發現布病、減輕布病對農業生產和人類健康的威脅提供技術支持。

電化學阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy，簡稱EIS)是電化學暫態技術，是以微小振幅的正弦波為擾動信號的電化學測量方法[3]，通過記錄載體表面的電容和界面的電子轉移阻抗等參數的變化來分析生物分子在載體表面的固定情況，以獲得更多關于體系的信息，提供評價分析生物學體系的電化學手段。例如，平倩倩構建了分子印記傳感器，通過交流阻抗譜法對大腸桿菌進行特異性檢測[4]。許麗等設計了檢測大腸桿菌數量的電化學阻抗傳感器[5]。Santos等用EIS方法構建了檢測大腸桿菌的傳感器[6]。由相關研究可知，電化學阻抗譜技術在免疫復合物的檢測上已有很好的應用，在頻率域上用電化學阻抗譜定量檢測抗體可以獲得更全面的信息。本試驗在有氧化還原對{[Fe(CN)6]3-/4-}存在的情況下進行測試，通過表征電極界面的性質來檢測抗原抗體復合物[7]，構建阻抗型免疫傳感器，為低濃度布魯氏菌抗體定量檢測的深入研究奠定良好基礎。本試驗于2014年在山西農業大學生物電子與傳感器實驗室完成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要試驗材料為由中國獸醫藥品監察所提供的布魯氏菌病試管凝集試驗抗原和布魯氏菌標準陽性血清(抗體)；主要試劑有羅氏公司提供的牛血清白蛋白；其他試劑有亞鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鐵氰化鉀、氯化鉀、磷酸二氫鈉等。所有試劑均為分析純。

1.2 溶液配制

磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution，簡稱PBS)的配制：稱取適量磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，溶入超純水配成 10 mmol/L 溶液后，加入0.9%氯化鈉，然后將溶液的pH值調至7.4，經高溫高壓滅菌后，于4 ℃冰箱保存備用。

電解液的配制：將0.823 1 g鐵氰化鉀、1.056 1 g亞鐵氰化鉀和0.745 5 g氯化鉀溶入PBS中，定容到100 mL，即配制成5 mmol/L支持電解液。

牛血清白蛋白溶液(bovine serum albumin，簡稱BSA)：1% BSA，配制方法為將25% BSA溶于適量PBS中，使用時配制。

1.3 布魯氏菌抗原、抗體溶液的準備

布魯氏菌抗原用PBS稀釋成濃度為4×109CFU/mL的抗原溶液。布魯氏菌抗體按10倍梯度稀釋成濃度為1×10-4～1 IU/mL的5個濃度梯度的抗體溶液。

1.4 免疫電極的制備

絲網印刷金電極用水潤洗，在工作電極上滴涂10 μL抗原溶液，于37 ℃恒溫、恒濕盒中放置1 h，取出后重復清洗2次。然后用牛血清白蛋白溶液封閉未反應的非特異性位點[8]，于37 ℃恒溫、恒濕盒中靜置1 h，再充分清洗，除去未結合的牛血清白蛋白。

1.5 免疫傳感器的檢測方法

本試驗采用同一電極依次修飾不同濃度梯度抗體的方法[9]。在電化學阻抗譜的初始電位為0.13 V、頻率范圍為 0.1～100 000 Hz、交流擾動信號幅值為0.005 V的條件下進行測試。測試液為電解液，全部試驗在室溫下進行。

1.6 數據分析

本試驗數據主要用Origin 8.5軟件和Zsimpwin軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 初始電位及頻率范圍的選擇

在進行交流阻抗測試時，初始電位的選擇會影響交流阻抗譜曲線的變化。本試驗以絲網印刷金電極-抗原-BSA-抗體(即在絲網印刷金電極上修飾抗原，然后用BSA封閉，再綁定抗體進行測試)電極作為工作電極，通過改變參數確定合適的初始電位。分別選擇 0.13、0.22 V作為考察電位。如圖1所示，該曲線包括2個部分，即接近半圓的部分和直線部分，分別對應電子傳遞過程和擴散過程。當設置電位為0.13 V 時，曲線接近半圓的部分直徑最小，接近開路電位，測試對傳感器體系的影響最小，更利于反映傳感器的真實性質。通常當測試頻率小于0.001 Hz時，EIS為電解質的導電率，當測試頻率大于100 kHz時，體系內的感抗值發生變化[10]。因此，選擇初始電位為0.13 V，工作頻率范圍為0.1～100 000 Hz。

2.2 免疫傳感器的Bode圖分析

Bode圖用于描述電化學體系中阻抗模的對數(lgZ)和相位角與頻率對數(lgFreq)的關系。在Nyquist圖中，頻率值是隱含的，尤其在高頻區，要標出每個點的頻率比較困難，而Bode圖可獲得傳感器體系對頻率響應的相關信息，是表示EIS測試結果更有效的方法[11]。

在本研究中，當用免疫傳感器測試不同濃度的抗體后，在Bode圖譜中布魯氏菌抗體的阻抗值對數隨頻率對數的變化規律如圖2-a所示，可以看出，當lgFreq值在-1.0～1.0之間的低頻段時，阻抗模的對數值隨著布魯氏菌抗體濃度由低到高變化，其值由小到大依次為1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1 IU/mL。如圖2-b所示，當lgFreq值在 -1.0～1.0之間的低頻段時，布魯氏菌抗體的相位角隨頻率對數由小到大變化，按照布魯氏菌抗體濃度值由低到高排列，該曲線能夠反映免疫傳感器的電阻和電容的綜合特性。

阻抗的實部、虛部對數值與頻率對數的關系如圖3所示，可以看出，在坐標系下部，當lgFreq值為0.6～1.6時，隨著頻率對數的增大，阻抗的虛部對數值逐漸增大，與布魯氏菌抗體濃度呈正比關系。在坐標系上部，當lgFreq值為-1～1時，隨著頻率對數值增大，阻抗的實部對數值逐漸減小，與布魯氏菌抗體濃度呈反比關系。免疫傳感器通過實部、虛部與頻率對數的關系曲線，能夠定性判斷布魯氏菌抗體濃度的變化規律。

2.3 免疫傳感器的交流阻抗特性

在上述確定的試驗條件下，將電極置于50 μL電解液中測試免疫傳感器的響應。用制備的免疫傳感器對濃度為1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1 IU/mL的布魯氏菌抗體溶液進行電化學阻抗譜測試，當測試信號通過免疫傳感器時，吸附到電極表面的免疫復合物會明顯地增大電極-溶液界面的阻抗[12]，出現濃差極化和電化學極化，這時電極的法拉第阻抗在高頻部分為雙電層的容抗弧，而在低頻部分，擴散控制將超過電化學控制，出現向右上方傾斜的直線，如圖4所示。當用免疫電極測試不同濃度的抗體時，電子轉移阻抗明顯增大，說明免疫傳感器上固定的布魯氏菌抗原與抗體發生了免疫反應，并已結合到電極表面形成免疫復合物，阻礙了氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面的傳遞，使其難以通過電極表面獲得電子。隨著免疫傳感器結合抗體濃度的逐步增加，電極表面的膜逐漸增厚， 圖4中半圓形的直徑隨著布魯氏菌抗體濃度的增大而增大。

2.4 免疫傳感器的等效電路模型

試驗后對測試數據通過Zsimpwin軟件擬合，以此來模擬和推測電極界面所發生的物理化學過程，判斷電極的表面狀況。為了更好地分析本試驗的電化學體系，獲得電極表面動力學和擴散特征的相關參數，建立Randles模型對數據進行擬合[13]。

將免疫傳感器置于含有氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-的環境中，根據電化學阻抗譜測試后的數據建立等效電路，有助于對免疫傳感器系統測試結果中各組成部分作進一步探討，利用Zsimpwin軟件對電化學阻抗譜進行分析，探討電極界面的機制。在電化學極化和濃差極化同時存在的情況下，擬合的等效電路如圖5所示。可以看出，當發生極化時，由于界面濃度周期性變化產生了反映溶液中氧化還原探針擴散特性的Warburg阻抗。常相位角元件和電子轉移阻抗受到電極-電解質界面的介電特性和絕緣特性影響[14]。

筆者通過Zsimpwin軟件擬合每個濃度抗體測試后的阻抗數據。當抗體溶液的濃度為1×10-4～1 IU/mL時，等效電路中的Rs為(17.44+0.67)Ω，相對誤差為3.85%，說明Rs不受免疫傳感器表面復合物的影響。

由表1中的數據可知，免疫傳感器上結合抗體后電極的電子轉移阻抗發生了明顯的變化。由于抗原抗體形成非導電免疫復合物，電子轉移阻抗的變化值(ΔRct=Rct(Ab)-Rct(BSA))隨著抗體濃度的增加而逐漸增大。擬合曲線方程為y=288.83 lgC+1 556.11，相關系數為0.972 4。

表1 抗體濃度與電子轉移阻抗變化值的關系

3 結論

本試驗利用電化學阻抗譜測試技術實現了布魯氏菌抗體的定量檢測。通過Zsimpwin軟件對測試后的數據進行擬合，提出了免疫傳感器系統的等效電路，得到該體系的4個組成部分，即電解液電阻、常相位角元件、電子轉移阻抗和Warburg阻抗。在所有參數中電子轉移阻抗改變量最大，當布魯氏菌抗體溶液濃度在1×10-4～1 IU/mL范圍時，Ret的變化值與布魯氏菌抗體溶液濃度的對數值呈線性關系，相關系數為0.972 4。與其他測試方法相比，電化學阻抗譜以小振幅的正弦波信號對體系進行擾動，避免對體系產生大的影響，簡化了測試數據的處理過程。