高效液相色譜分析不同理化因素對血紅素輔基穩定性的影響

劉 越， 孫 沖， 李鵬鵬， 張新笑， 徐為民

(1.南京農業大學，江蘇南京 2100952； 2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京 210014)

肉色是肉品的一個外在指標，肉品的色澤可以直觀反映其新鮮程度，是其能否被消費者接受的關鍵因素[1]。新鮮牛肉的顏色為櫻桃紅色，在空氣中放置后會很快變為鮮紅色，之后又轉變為褐色[2-3]，即使在冷藏期間，顏色也會隨時間發生改變[4]。在肉品貯藏和加工過程中，肉色的保持并非易事，需要探究肉品色澤變化的機制，采取合適的保護措施以盡可能地減少肉色損失。肉品的色澤主要由肌紅蛋白決定，肌紅蛋白由珠蛋白和1個血紅素輔基構成，而肌紅蛋白的顏色主要受血紅素輔基結構和氧化狀態的影響，如果血紅素輔基結構發生改變，肌紅蛋白的結構和功能也很可能發生變化。血紅素輔基是由(亞)鐵離子和原卟啉形成的復合物[5]，其中心的鐵原子與卟啉環形成4個配位鍵，鐵原子的第5配位位置由組氨酸的咪唑氮原子在軸向結合形成配位鍵，第6配位位置可同氧或其他小分子結合，鐵原子電子狀態的變化會直接影響整個血紅素的電子狀態，從而表現出不同的吸收光譜[6-7]。

在動物從被屠宰到肉品銷售過程中，肉品貯藏和運輸期間的時間因素、加工過程中溫度和pH值的變化，以及常見的食品添加劑氯化鈉、消毒劑次氯酸鈉[8]等理化因素都可能對肉品的色澤產生一定的影響。以往有研究表明，在時間、pH值、溫度等理化因素下，肉品的肉色表現出一定的變化規律[9-10]，但是對于血紅素輔基穩定性的研究很少。本研究擬更深入地分析肌紅蛋白上的關鍵結構血紅素輔基，通過試驗探究在不同理化因素下血紅素輔基穩定性的變化規律。以往研究肌紅蛋白及血紅素輔基大多采用紫外光譜法[11]，該方法在抗干擾、定量的準確程度等方面存在一定的缺陷。本研究采用反相高效液相色譜法探究不同理化因素對血紅素輔基穩定性的影響，以更加精確地分析血紅素輔基受不同理化因素的影響程度，從而深入地了解影響血紅素輔基結構穩定性的關鍵因素，為將來控制肌紅蛋白血紅素輔基結構的變化、穩定肉色提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

新鮮牛肉，購自南京市玄武區下馬坊蘇果超市；肌紅蛋白標品為馬骨骼肌紅蛋白(美國Sigma公司)。其他試劑均為分析純，所有溶液均用超純水配制。

M124A萬分之一分析天平(意大利BEL公司)；WH2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；FE20實驗室pH計[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；HH8數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；SPX250C恒溫培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司)；UPC10AKTA蛋白純化儀(美國GE Healthcare)；Sephadex G200凝膠柱(美國GE Healthcare)；Waterse2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；AgilentZX26液相色譜串聯飛行時間質譜儀(美國Agilent Technologie公司)。

1.2 試驗方法

牛肉肌紅蛋白的提取參考Thiansilakul的方法并加以修改[12]。

1.2.1 肌紅蛋白粗提物的提取 取100 g肉糜與300 mL冷的萃取介質[50 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl，pH值8.0]混勻，10 000 r/min 勻漿1 min，然后于9 600g離心15 min，吸出上清液于飽和度為75%的硫酸銨中鹽析1 h，將上清液于 10 000 r/min 離心30 min，取粉紅色的上清液，將鹽析的蛋白質上清液置于透析袋中(截留分子量為7 000 u)，通過10倍體積的預冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值8.0)透析除去硫酸銨，將透析袋置于冷凍恒溫搖床中，轉速為 100 r/min，透析液換10次，即得到肌紅蛋白的粗提物，所有提取過程在4 ℃條件下進行。

1.2.2 蛋白層析分離純化 肌紅蛋白純化用的層析柱為Sephadex G200凝膠柱，進樣前先用冷的Tris-HCl緩沖液(50 mmoL，pH值為8.0)平衡凝膠柱，將透析后的肌紅蛋白經0.2 μm濾孔過濾后進樣，每次上樣1 mL，流速為 1 mL/min，紫外檢測波長為280 nm，收集出峰位置的溶液于10 mL EP(Eppendorf)管中，4 ℃保存。

1.2.3 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE)分析 SDS-PAGE電泳樣品前處理：在0.2 mL除鹽后的純化蛋白液中加入0.4 mL上樣緩沖液后于95 ℃處理 5 min。SDS-PAGE電泳采用15%分離膠，5%濃縮膠，每孔等體積上樣20 μL，電泳電壓為160 V，持續時間為50～60 min，取出凝膠塊，用考馬斯亮藍染色液染色10 min后取出，加入適量的脫色液，放在搖床上使脫色更加均勻迅速，1 h后更換脫色液，直至脫色完成，取出凝膠塊，用凝膠成像儀進行成像分析。

1.3 液相收集與質譜分析

分別收集反相高效液相色譜出峰位置的液體，隨后利用固相萃取(solid phase extraction，簡稱SPE)柱對收集液進行凈化濃縮，用氮氣吹干至乙腈完全去除，用少量雙蒸水溶解管壁內的溶質，最后用液相色譜串聯飛行時間質譜進行分析。

質譜條件。離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；離子化條件：氣溫與流速分別為300 ℃、3 μL/min，針泵直徑為 2.3 mm，毛細管電壓為5.5 kV，采集時間為0.5 s，霧化器壓力(GS1)、輔助器壓力(GS2)均為206.842 7 kPa。數據通過分析軟件PeakView進行定性分析。

1.4 液相色譜分析

1.4.1 色譜條件 色譜柱：C18反相色譜柱；流動相：A為 0.1% 三氟乙酸(TFA)溶液，B為0.1% TFA-乙腈；流速為 1 mL/min；柱溫為25 ℃；波長為210～410 nm。洗脫梯度：0～10 min，5%～60% B；10～20 min，60% B；20～25 min，60%～5% B。

1.4.2 靜置時間對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 制備質量濃度為0.2 mg/mL的肌紅蛋白溶液，置于4 ℃冰箱中，放置0、1、3、5、7 d后分別進行液相分析。

1.4.3 溫度對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 制備質量濃度為0.2 mg/mL的肌紅蛋白溶液，置于4、20、30、40、50 ℃恒溫水浴鍋中水浴60 min后分別進行液相分析。

1.4.4 pH值對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 制備質量濃度為0.2 mg/mL的肌紅蛋白溶液，緩沖液pH值設為3、5、7、9、11，置于20 ℃恒溫培養箱中60 min后分別進行液相分析。

1.4.5 氯化鈉濃度對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 制備質量濃度為0.2 mg/mL的肌紅蛋白溶液，加入質量分數為 1%～5%的氯化鈉，置于20 ℃恒溫培養箱中60 min后分別進行液相分析。

1.4.6 次氯酸鈉對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 制備質量濃度為0.2 mg/mL的肌紅蛋白溶液，加入1%次氯酸鈉(將pH值調節至12)，空白處理用雙蒸水代替，置于37 ℃恒溫培養箱中1～6 h后分別進行液相分析。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

已知肌紅蛋白的相對分子質量約為16 ku，從圖1中可以看出，條帶4、條帶2(圈中所示的帶)處于同一位置，且泳道4中可見的條帶只有1個(圈中所示的帶)，說明條帶4對應的收集液為肌紅蛋白，且較純；與泳道4相比，泳道3中含有多條帶，說明肌紅蛋白粗提物經過蛋白層析儀處理后達到了較好的純化效果。

2.2 液相收集與電噴霧質譜(ESI-MS)分析

由高效液相色譜圖可見，在280 nm紫外波長下，肌紅蛋白在10.9、13.3 min處有較明顯的吸收峰；當波長為400 nm時，肌紅蛋白只在13.3 min處有明顯的吸收峰(圖2)。

由圖3可以看出，肌紅蛋白標品質譜圖的主要峰在 16 952.0 u 處，另外1個較明顯的峰在17 567.1 u處；由圖4可以看出，肌紅蛋白液相色譜在10.9 min處收集液的質譜圖的主要峰在 17 567.7 u 處，另外1個較明顯的峰在16 952.0 u 處；由圖5可以看出，肌紅蛋白液相色譜在13.3 min 處收集液的質譜圖的主要峰在 764.5、765.5 u處。

綜上分析可知，圖3、圖4這2個質譜圖的2個主要峰相似，相關研究表明，肌紅蛋白相對分子量在16 700.0 u左右，可以推斷16 952.0、17 567.1 u處的峰代表的是肌紅蛋白、珠蛋白。圖5中主要峰的相對分子量為764.5 u，推測該峰代表的是血紅素輔基，將該樣品通過紫外波長掃描可以發現，它在400 nm處有明顯的特征峰，可進一步得出肌紅蛋白液相色譜在13.3 min處收集的樣品是血紅素輔基。因此，在液相試驗考察各因素對血紅素輔基穩定性影響的研究中，選擇波長為400 nm、時間為13.3 min處的吸收峰作為參照。

2.3 液相分析

2.3.1 靜置時間對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 由圖6可以看出，血紅素輔基在400 nm處的紫外吸收峰面積隨著靜置時間的增加逐漸降低，在1～7 d間有顯著差異(P<0.05)，在1、3、5、7 d時，分別比0 d時降低了1.07%、8.83%、16.05%、22.29%，說明隨著時間的延長，血紅素輔基損失逐漸增加，并且在1 d后，其損失速率加快。推測其原因，可能由于肌紅蛋白在空氣中易發生自氧化，在自氧化過程中產生的自由基會反作用于肌紅蛋白，從而破壞肌紅蛋白上的血紅素輔基，造成血紅素輔基的損失[13]。有研究表明，隨著時間的延長，從肌紅蛋白上脫落的血紅素輔基會進一步發生裂解，鐵離子從卟啉環中游離出來，留下空位的卟啉環，造成其吸收峰強度的降低[14-15]。

2.3.2 溫度對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 圖7結果顯示，隨著溫度的升高，血紅素輔基在400 nm處的紫外吸收峰面積無明顯差異，說明在4～50 ℃、60 min內，血紅素輔基的穩定性受溫度的影響不大。結果表明，在50 ℃以下時，隨著溫度的升高，肌紅蛋白自動氧化程度隨著溫度的升高而增加[16]。但試驗結果顯示，在4～50 ℃、60 min內血紅素輔基吸收峰強度無明顯差異，說明溫度可能會加快肌紅蛋白的氧化速率，即促進血紅素輔基上的二價鐵離子氧化成三價鐵離子[17]，但血紅素輔基的結構并未被破壞，在該溫度下血紅素輔基結構較穩定。也有研究表明，當溫度達到70 ℃時，血紅素輔基特征峰消失，說明過高的溫度依然會破壞血紅素輔基的結構[16]。

2.3.3 pH值對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 圖8結果顯示，pH值在3～11間時，血紅素輔基在400 nm處的紫外吸收峰面積有明顯差異(P<0.05)，pH值=9時最大，pH值小于9時逐漸降低。在堿性環境中血紅素輔基的吸收峰強度大于酸性環境中的，說明血紅素輔基在偏堿性環境下較穩定，酸性環境會降低血紅素輔基的穩定性，而且pH值越低，越不利于血紅素輔基結構的穩定。血紅素輔基在不同pH值下吸收峰面積的變化，可能是由于其共軛體系被破壞或者鐵離子游離了出來。許多研究也顯示，肌紅蛋白在酸性條件下其特征峰吸收強度明顯降低，還有研究表明，在酸性條件下肌紅蛋白更易發生自氧化[18]，質子取代反應是酸性條件下血紅素蛋白自動氧化加速的主要原因[19]，當pH值下降到3及以下時，肌紅蛋白血紅素輔基的結構會受到較大程度的破壞[20]。

2.3.4 鹽濃度對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 由圖9可以看出，對于氯化鈉質量分數為1%～5%的肌紅蛋白樣品，其血紅素輔基在400 nm處的紫外吸收峰面積無明顯差異。說明在氯化鈉質量分數為1%～5%的肌紅蛋白溶液中，其血紅素輔基結構的穩定性基本不受鹽濃度的影響。有報道表明，在肌紅蛋白溶液中添加1%～5%的氯化鈉，肌紅蛋白的氧化程度無明顯變化，通過紫外掃描其在400 nm左右的特征吸收峰強度也無明顯差異，說明血紅素輔基的結構相對穩定[21]。因此，將氯化鈉作為肉品中常用的添加劑時，在一定范圍內，其對肌紅蛋白血紅素輔基的穩定性無明顯影響。

2.3.5 次氯酸鈉對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 從圖10可以看出，用1% NaClO(稀釋到pH值為12)處理后的樣品的峰面積明顯低于空白對照組，在開始的1 h時就有較大差異，峰面積較空白對照降低了8.72%，說明加入NaClO明顯破壞了血紅素輔基，使其在400 nm處的特征吸收峰降低。隨著時間推移，1% NaClO處理后的樣品的峰面積逐漸降低，在1～5 h 間其峰面積有顯著差異(P<0.05)，5 h時其吸收峰面積與空白對照相比降低了18.99%，5 h后則趨于平緩，說明NaClO對血紅素輔基的作用隨著處理時間的增加而逐漸增強，到5 h左右作用完全；空白組峰面積基本保持不變，說明血紅素輔基在該環境下是比較穩定的。當加入5% NaClO(稀釋到pH值為12)時，液相色譜圖中原先肌紅蛋白的2個峰基本消失，說明該劑量的次氯酸鈉對肌紅蛋白、血紅素輔基的結構產生了很大的破壞。

次氯酸鈉反應后的分解產物是氯離子、氯酸根離子。由于工業生產中使用的亞氯酸鈉、次氯酸鈉的濃度都較低，且對豬肉的處理方法是浸泡，因此豬肉上殘留的防腐劑及防腐劑的分解產物是微量的，在這樣的范圍內可認為是對人體無害的[22-23]。但是一定濃度的次氯酸鈉會破壞肌紅蛋白的血紅素輔基結構，所以在工業生產中，應控制次氯酸鈉的添加量以減少對血紅素輔基的影響，從而使肉色更加穩定。

3 結論

上述試驗表明，在一定條件下，肌紅蛋白血紅素輔基損失隨處理時間的延長而持續增加；在4～50 ℃范圍內，溫度對血紅素輔基結構穩定性的影響不顯著；血紅素輔基在偏堿性環境下較穩定，酸性環境會影響血紅素輔基的穩定性，且pH值越低，越不利于血紅素輔基結構的穩定；在一定質量分數范圍內，氯化鈉不會破壞血紅素輔基的結構，不同鹽濃度下血紅素輔基的穩定性無明顯差異；一定濃度的次氯酸鈉會破壞血紅素輔基的結構，并且隨著處理時間的延長，其作用越強。