油樟、油樟寄生植物及桂花內生菌區系分布差異研究

張 萍， 馬 鑫， 王 濤， 游 玲，2， 魏 琴，2

(1.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓 644000； 2.香料植物資源開發與利用四川省高校重點實驗室，四川宜賓 644000)

植物生長的生態環境為內生菌的主要來源，已有大量研究揭示了其對植物內生菌的重要影響，如汪立群等用分離培養的方法，發現安徽的紫娟、云抗10號2種茶樹的內生菌優勢種屬與季愛兵采用云南生長的同一品種樣品得到的優勢種屬不一致[1-2]，說明不同生態環境中的同品種植物內生菌構成存在明顯差異。王海采用PCR-DGGE和DNA測序技術發現相同產地川芎的內生真菌群落結構相似程度較高，不同產地間的相似程度較低[3]。近年來，高通量測序技術成為微生物區系研究的主要方法[4]，在植物內生菌研究領域也得到了廣泛應用，證實環境對植物內生菌區系分布的影響比我們認識的更加重要。如Hong等發現九龍河口的多種濕地植物有著相似的優勢內生菌[5]。馬昭采用高通量測序及純培養相結合的方法發現野生鐵皮石斛內生菌的生物多樣性和群落結構有別于人工栽培種，且各產地野生種鐵皮石斛表現出各自獨特的內生菌種群分布和群落結構特征[6]。趙維殳等也發現不同產地魚腥草內生細菌的群落結構間有著明顯的差異[7]。

油樟[Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N. Chao ex H. W. Li.]屬樟科(Lauraceae)，為國家Ⅱ級重點保護野生植物，主要用于樟油生產，四川宜賓為油樟的主產區，其枝葉中所含揮發油成分與其他產地的油樟有明顯差異[8]，已經證實這些揮發性代謝產物的形成與其內生真菌有關[9]，表明油樟內生菌與宿主之間存在緊密聯系。在野外調查中，筆者發現四川省宜賓縣隆興鄉的油樟母本園的部分植株上著生有寄生植物，其枝葉完全沒有油樟油特有的氣味，由于該寄生植物與油樟生長環境、營養條件完全相同，僅植物基因型不一致，可作為研究宿主遺傳特性(及其表型)對內生菌分布的影響的一種模型。因此本研究以油樟、油樟寄生植物及同一生長環境的喬木桂花為研究對象，探討植物生長環境及遺傳特性對內生菌區系分布的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及來源

油樟、油樟寄生植物和桂花葉片均采自四川省宜賓縣隆興鄉油樟母樹繁育基地，基地地形為丘陵山地，面積21.67 hm2，林內均為胸徑10～20 cm的油樟樹，林下環境潮濕蔭蔽，地面苔蘚密集，植物種屬較少，無其他喬木，僅邊緣有桂花樹零星分布。林中部分油樟樹冠上著生有喬木類寄生植物，經查閱《中國植物志》[10]，并與四川大學植物標本館中的相關植物標本比較，將油樟的寄生植物鑒定為桑寄生[Taxillussutchuenensis(Lecomte) Danser]。

采樣地點海拔358.3 m，經度104.45°，緯度20.02°，時間為2016年1月下旬，采樣時葉片處于生長完全階段，少幼葉，按照多點采樣方式，在油樟母本園方圓約200 m2范圍里，分別選取3株長有桑寄生、無明顯病蟲害、胸徑約15 cm油樟樹及相鄰50 m左右的3株桂花樹，采集3種植物不同朝向、不同高度的葉片，分別混勻，馬上送回實驗室進行后續處理。

1.2 方法

1.2.1 葉片表面消毒 將剛剛采集的葉片用清水沖洗1 min使泥土洗凈后，自然風干。75%乙醇浸泡60 s，后用無菌水沖洗葉片表面至少6次，最后1次無菌水取200 μL涂布PDA固體培養基，于28 ℃下培養，3～5 d內每天定時查看是否長菌。

1.2.2 提取葉片總DNA 采用Omega試劑盒提取葉片總DNA，按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 PCR擴增 內生細菌擴增引物為338F(ACTCCTA-CGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAA-T)[11]，內生真菌引物為ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAGT-AA)和2043R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)[12]。PCR反應體系為25 μL，PCR反應條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27個循環；72 ℃ 10 min。用3 μL上樣、2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，PCR擴增產物由上海美吉生物醫藥科技有限公司采用Illumina平臺測序。

1.2.4 數據分析 過濾尾部質量值20以下的堿基及質控后50 bp以下的序列，再拼接，按最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列，對優化后的序列提取非重復序列，利用Usearch(vsesion 7.1 http：//drive5.com/uparse/)軟件平臺，按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，并繪制熱圖。利用silva數據庫鑒定細菌種屬[13]，利用Unite數據庫鑒定真菌種屬[14]，利用Mothur軟件進行Alpha多樣性分析，分別計算香農指數(Shannon)、Chao1指數、辛普森指數(Simpson)和物種豐富度指數(ACE)[15]，利用R軟件制作Venn圖。

2 結果與分析

2.1 序列質量分析

對細菌3個樣品共測得序列120 401條，其平均序列長度為429 bp，其中420～460 bp的序列占99.97%，真菌 131 058 條，其平均序列長度為278 bp，其序列長度分布如圖1所示。

2.2 內生細菌區系分布差異

從表1可以看出，油樟葉內生細菌的多樣性最大，桑寄生次之，桂花最少。總體上，油樟葉片中內生細菌種類豐富，菌群結構較穩定，桂花葉片中雖有效序列條數最多，但菌群種類單一，菌群穩定性較差。

表1 3種植物葉內生細菌多樣性比較

注：“GH”表示桂花，“JS”表示桑寄生，“YZJS”表示長有桑寄生的油樟。下同。

排除線粒體DNA，在屬一級水平上，桂花內生細菌豐度大于1%的屬有芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、Faecalibacterium、乳球菌屬(Lactococcus)、嗜堿菌屬(Alkaliphilus)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)，其豐度分別為 8.02%、3.37%、3.37%、2.03%、1.39%、1.09%，其他豐度小于1%的種屬合計共占3.17%。油樟內生細菌豐度大于1%的屬有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Alkaliphilus、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)下一個未鑒定屬、 類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、海洋桿菌屬(Oceanobacillus)，其豐度分布為40.19%、16.20%、11.89%、5.68%、4.42%、1.54%、1.38%，其他豐度小于1%的種屬合計共占3.37%。桑寄生內生細菌豐度大于1%的屬有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Alkaliphilus、Enterobacteriaceae科下一個未鑒定屬，其豐度分別為14.72%、5.46%、3.81%、1.72%、1.61%，其他相對豐度小于1%的種屬合計共占1.8%。

從圖2可以看出，油樟、桑寄生、桂花3種植物共有的細菌屬有17個，獨有的屬分別僅有7個、1個、4個，表明3種植物的內生菌主要來源于環境，獨有的這些屬與這3種植物的遺傳特性有關。有2個屬僅在油樟、桑寄生中分布，表明這2個屬與油樟、桑寄生相同的營養環境有關。

從圖3可以看出，生長環境相同的桂花、油樟和桑寄生葉內生細菌的優勢種屬(相對豐度>1%)的構成及豐度不完全相同。與寄主植物油樟相比，桑寄生葉及桂花葉內生細菌的種屬構成更為相似，除Pseudobutyrivibrio、Faecalibacterium、念珠菌屬(Candidatus)僅在桂花葉內分布，莫拉氏菌屬(Moraxella)僅在桑寄生葉內分布外， 其余各屬在2種植物內的分布差異僅體現在豐度上，且梭菌屬(Clostridium)、土芽孢桿菌屬(Geobacillus)、Bacillus等優勢屬在桑寄生葉及桂花葉內的分布及豐度相似，但與桑寄生葉內生細菌相比，Candidatus僅分布于油樟葉內，Bacillus、Clostridium、Geobacillus、Lactococcus、Enterococcus在油樟葉內生細菌中的豐度也明顯高于桑寄生，桑寄生與油樟葉內生細菌區系構成差異明顯高于桑寄生與桂花。說明在相同環境背景下，植物內生細菌種屬構成非常相似，但植物遺傳特性對不同植物內生細菌的分布仍有2個方面的主要影響，一是不同植物內生細菌各種屬的相對豐度不同，二是不同植物對某些種屬細菌具有選擇性。并且，相同的大環境及營養環境不能使油樟及其寄生植物擁有完全相同的內生細菌。考慮到寄主及寄生植物結構相互聯通，內生細菌可自由遷移，有差異的種屬來自種子垂直傳播的可能性較小，更主要的原因可能在于植物遺傳特性導致的葉內代謝產物不同， 而這些代謝產物在不同程度上調控著各種屬內生細菌的生長。

2.2 內生真菌區系分布差異

從表2可以看出，油樟及桑寄生內生真菌的多樣性明顯高于桂花，其群落結構也更穩定。在屬一級分類水平上，桂花內生真菌測得序列數量超過500條的屬有未鑒定的子囊真菌屬、未鑒定屬、煤炱目(Capnodiales)下一個未鑒定屬、鐮刀霉屬(Fusarium)、類擔子菌酵母屬(Derxomyces)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)下一個未鑒定屬、瓶霉屬(Phialophora)，其豐度分別為68.83%、6.61%、5.50%、5.48%、2.66%、2.24%、1.38%，測得序列條數少于500條的其他種屬合計共占7.3%。油樟內生真菌測得序列數量超過500條的屬有未鑒定的子囊真菌屬、Mycosphaerellaceae科下一個未鑒定屬、未鑒定屬、平臍疣孢屬(Zasmidium)、Capnodiales目下一個未鑒定屬、散囊菌目(Eurotiomycetes)下一個未鑒定屬、銀耳目(Tremellales)下一個未鑒定屬、考克娃酵母屬(Kockovaella)，其豐度分別為42.18%、16.31%、13.25%、9.82%、7.97%、1.31%、1.15%、1.13%，測得序列條數少于500條的其他種屬合計共占6.88%。油樟的寄生植物桑寄生測得序列數量超過500條的屬有未鑒定的子囊真菌屬、未鑒定屬、Capnodiales目下一個未鑒定屬、Derxomyces、Zasmidium、Mycosphaerellaceae科下一個未鑒定屬、新擬盤鄉毛孢屬(Neopestalotiopsis)、假小尾孢屬(Pseudocercosporella)、Phialophora，其豐度分別為50.43%、11.09%、9.92%、4.30%、4.27%、3.98%、2.52%、1.64%、1.39%，測得序列條數少于500條的其他種屬合計共占10.46%。

從圖4可以看出，桂花、油樟和桑寄生的共有屬達188個，獨有屬分別僅有53、31、88個，且油樟及其寄生植物內生真菌共有屬的數量不超過桂花與桑寄生內生真菌共有屬的數量，表明在相同環境背景下，不同植物的內生真菌種屬非常相似，完全相同的環境及營養條件并不能增加共有屬的數量，造成不同植物內生真菌種屬差異的主要原因仍是植物遺傳特性。

從圖5可以看出，同一環境中的桂花、油樟及其寄生植物的內生真菌主要優勢種屬均包括未鑒定的子囊真菌、未鑒定屬、Teratosphaeriaceae科下一個未鑒定屬、Capnodiales目下一個未鑒定屬，表明這4個屬的真菌主要來自其生長環境。

從聚類分析來看，與桂花相比，油樟和桑寄生的內生真菌區系構成更接近，體現在油樟及桑寄生內生真菌的主要優勢屬，包括未鑒定的子囊真菌屬、Tremellales目下一個未鑒定屬、Teratosphaeriaceae科下一個未鑒定屬、Capnodiales目下一個未鑒定屬及毛孢子菌屬(Trichosporon)，其次，裂褶菌屬(Schizophyllum)、長蠕孢屬(Helminthosporium)、Kockovaella及1個未鑒定屬的豐度均較為相近，但兩者仍有22個屬的內生真菌豐度差異較大，如青霉素(Penicillium)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)只在油樟中分布，這些屬可能與樟油的形成有關[7]，布勒擲孢酵母屬(Bullera)、綠霉菌屬(Metarhizium)、被孢霉屬(Mortierella)只在桑寄生中分布，由于油樟及其寄生植物桑寄生除植物遺傳特性不同外，生長環境及營養條件完全一樣，因此，兩者對上述種屬內生真菌的選擇性可能主要源于植物遺傳特性。

3 討論

從研究方法來看，本課題組曾采用培養法發現油樟優勢真菌為組絲核菌屬(PhacodiumPers.)和痂圓孢屬(Sphacelomade Bary)[8]，與本研究采用高通量測序發現的油樟優勢內生真菌明顯不同，且由于避免了培養條件的選擇性，使用該方法揭示的內生菌數量、種屬都遠遠超過傳統的純培養方法[16-17]，表明在內生菌的多樣性研究方面，高通量測序法能更加真實地反映植物內生菌的實際區系構成，但植物內生菌資源的開發利用仍需要結合傳統的純培養方法，以獲得純培養菌株或某種富集條件下的菌群。

從植物內生菌與環境的關系來看，同一環境的不同植物擁有高度相似的內生細菌及內生真菌種屬，不同來源植物內生真菌區系構成差異較大，以桂花為例，盧東升等采用平板培養基誘導產孢分離得到桂花葉片4種優勢種屬大莖點霉屬(Macrophoma)、鏈格孢屬(Alternaria)、刺盤孢霉屬(Colletotrichum)、擬莖點霉屬(Phomopsis)[18]，而本研究中桂花優勢種屬則為未鑒定的子囊真菌、Tremellales目下一個未鑒定屬、Teratosphaeriaceae科下一個未鑒定屬、Capnodiales目下一個未鑒定屬、Fusarium、Derxomyces，除研究方法的差異外，桂花來源的不同可能是造成其內生菌區系差異的主要原因，植物內生菌的區系構成與其生長環境具有非常密切的關系，脫離植物生長環境來研究某種植物的內生菌區系構成是不科學的，恰當的做法是將內生菌作為一個群體，研究其與宿主、環境的生態關系。在本研究中，3種具有迥異化學成分的植物，其內生菌區系構成卻高度相似，可能是由于生長在相同環境的植物容易獲得相似的內生菌，但這些內生菌中絕大多數與植物之間的聯系較松散，無論是植物內部，還是外部的相鄰環境，都僅僅是作為其適宜的居留地，僅有少數內生菌特別是內生真菌與植物之間存在不同程度的共代謝關系[19-20]。如誘導、激活植物形成某些活性代謝產物，同時這些代謝產物又反過來對內生菌的分布產生影響[21]，這在一定程度上解釋了道地藥材的部分成因[22]。本研究通過比較油樟、油樟寄生植物、油樟相鄰喬木桂花內生菌區系差異，也從另一角度證實了生態環境對植物內生菌分布的重要影響，為植物生長的微生物生態環境保護提供了依據，也為植物內生菌資源的開發利用提供了重要參考。