土壤水溶性有機碳的高錳酸鉀氧化比色法測定研究

王 星， 孫沙沙， 王桂紅， 王萍萍， 郭 振， 焦克強， 段建軍， 王小利

(1.貴州大學農學院，貴州貴陽 550025； 2.貴州大學煙草學院/貴州省煙草品質研究重點實驗室，貴州貴陽 550025)

水溶性有機碳(water-soluble organic carbon，簡稱WSOC)通常是指能通過0.45 mm微孔濾膜的水溶性有機物質[1]，是陸地生態系統極為活躍的有機碳組分，雖然它在土壤中含量很低，一般不超過200 mg/kg[2]，但容易被土壤微生物物吸收和利用[3]，對調節土壤陽離子淋失、土壤中有機和無機物質的轉化、遷移和降解也起到重要的作用[4-6]，因此，土壤水溶性有機碳的測定已成為土壤化學性質分析的一個重要項目。

目前，WSOC的測定方法主要有：重鉻酸鉀-濃硫酸外加熱容量法(濕氧化法)[7-8]、總有機碳測定儀(TOC)法測定[9]。濕氧化法由于不能保證樣品完全氧化，并且測定所需時間長，很難消除鉻和強酸，測定結果誤差較大[10]；干燒法有機碳氧化所需溫度高，儀器比較昂貴，并且測定之前須對提取液蒸干，操作復雜、費時，整體分析運行成本偏高[11-12]。因此，找到一種廉價、操作簡單、具有一定精度的WSOC測定方法對WSOC的研究具有重要意義。

WSOC是一種活性有機碳，目前，土壤活性有機碳常用的測定方法是高錳酸鉀氧化比色法[13-14]，即根據土壤與高錳酸鉀作用后高錳酸鉀的消耗量來計算土壤活性有機碳的含量。本研究在活性有機碳測定的基礎上，通過分析高錳酸鉀比色液吸收曲線、反應時間、標準曲線的制作等因素，以期創建一種準確、簡單、方便的WSOC測定方法。

1 原理

活性有機碳高錳酸鉀氧化法測定的具體步驟[15]：取含有15 mg碳土壤樣品于離心管中并加入25 mL的333 mmol/L高錳酸鉀，振蕩或靜置一定時間，離心后取上清液用去離子水以1 ∶250稀釋，在分光光度計565 nm下測定稀釋樣品的吸光度，由不加土壤的空白對照與土壤樣品的吸光長之差，計算出高錳酸鉀濃度的變化，并進而計算出氧化的碳量(氧化過程中高錳酸鉀濃度變化1 mmoL可消耗9 mg碳[16])，而土壤中水溶性有機碳的含量一般不超過200 mg/kg，根據假設，在氧化的過程中高錳酸鉀濃度變化1 mmol/L可消耗9 mg碳，為此本研究采用4 mmol/L的高錳酸鉀氧化水溶性有機碳，從而測定出水溶性有機碳的含量。以草酸溶液、水楊酸溶液為標準物質做參比，土壤樣品分別采用高錳酸鉀氧化比色法和TOC進行測定，并進行相關統計分析，對新方法進行評價。

式中：B為高錳酸鉀濃度變化值(mmol/L)，濃度變化值通過查標準曲線確定；V1為比色液的體積(mL)；9為高錳酸鉀氧化碳的比例系數；V2為WSOC浸提的水的體積(mL)；V3為定容時使用的離心上清液的體積(mL)；m為烘干土樣質量(g)。

2 材料與方法

2.1 試劑與儀器

4 mmol/L的高錳酸鉀溶液。由于高錳酸鉀自身氧化性較強，與還原性物質易發生反應，例如空氣中的塵埃及氨等還原性物質[17]，影響溶液的穩定性。另外，高錳酸鉀溶液見光易分解，很難長期穩定保存，所以本實驗使用的高錳酸鉀溶液均為現配現用，并避光保存。所用水均為蒸餾水。吸光度的測量和波長的掃描均采用分光光度計。

2.2 試驗方法

2.2.1 高錳酸鉀比色波長和反應時間的確定 配制 4 mmol/L 的高錳酸鉀溶液100 mL，吸取5 mL于100 mL容量瓶用蒸餾水定容；定容后的溶液在450～600 nm波長范圍內掃描(1 cm比色杯)，然后以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖得到高錳酸鉀的吸收曲線，曲線描述了高錳酸鉀對不同波長光的吸收能力。

取0.90、1.35 mg/L的草酸溶液分別與高錳酸鉀溶液反應，每30 min測定吸光度，直至反應完全，繪制在室溫條件下比色測定結果與顯色時間的關系圖，從而確定顯色時間。

2.2.2 高錳酸鉀標準曲線的制作 首先配制4 mmol/L的高錳酸鉀標準溶液，從標準溶液中吸取3、4、5、6、7、8 mL標準溶液轉移至100 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容(對應的濃度分別為0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mmol/L)，溶液同“2.2.1”節比色測定。以吸光度為橫坐標，高錳酸鉀濃度為縱坐標制作標準曲線。

3 結果與分析

3.1 高錳酸鉀氧化比色法的吸收曲線和反應時間

同一物質的吸收曲線隨波長的變動而變動，應取吸光度最大時對應的波長，此時比色更精確。本試驗中4 mmol/L高錳酸鉀的吸收曲線見圖1。從圖1可以看出，在480 nm～530 nm 處出現2個吸收峰，其中在490 nm和525 nm吸收值相差不大，因此在比色的時候，可以選擇在490 nm、525 nm處進行測定。

待測液與4mmol/L高錳酸鉀溶液的反應時間對于比色測定結果也有很大影響，如果反應時間太短，待測液反應不完全，造成結果偏低；反應時間太長，已經穩定的顏色就可能會褪去，導致結果偏高。由于水溶性有機碳的含量比較低，所以要保證待測液的量完全被高錳酸鉀所氧化，在本試驗中 4 mmol/L 的高錳酸鉀溶液理論上最多消耗2.16 mg的C。配制0.90 mg/L、1.35 mg/L的草酸溶液反應與高錳酸鉀的反應時間見圖2。

由圖2可見，0.90、1.35 mg/L的草酸溶液分別與高錳酸鉀反應在0～2 h內吸光度均呈下降趨勢；在2～8 h內，2種溶液吸光度基本保持穩定，差異不顯著(P<0.05)。

為進一步確定顯色時間，在0.5、1、1.5、2、8 h測定2種不同濃度待測溶液的水溶性碳的值，結果如表1所示，在0.5、1 h時，2種待測液測定值比標準值小，并且相差比較大，可能是反應時間太短，樣品反應不是很完全；而在1.5、2、8 h時，2種待測液的測定值均與標準值相差不大，這說明在 1.5～8 h 時，溶液中的碳已反應完全，而在 2 h 時水溶性有機碳的回收率高于1.5 h時的回收率且測定值也更接近理論值，因此比色時間取2 h即可，能達到節能、高效的效應。

表1 不同時間下可溶性碳的測定值

注：平均值為C濃度，回收率指測量值占標準值的百分數。

3.2 不同種類有機碳化合物高錳酸鉀氧化比色法與TOC儀器法測定結果的比較

分別配制0.45、0.90、1.35 mg/L的草酸溶液、水楊酸溶液比色測定(每個濃度梯度設置10個平行)，并與理論含碳值和TOC儀器法測定結果進行比較分析。

表2結果顯示，TOC儀器法測定6種樣品的測定結果均高于高錳酸鉀氧化比色法的測定結果，高錳酸鉀氧化比色法測定的樣品回收率小于TOC儀器法測定結果，這說明TOC儀器法對有機碳氧化得更完全。高錳酸鉀氧化比色測定結果和TOC儀器法測定結果之間呈極顯著相關性，與TOC儀器法測定結果的相對偏差相比，高錳酸鉀氧化比色法的相對偏差更大，這說明TOC儀器法更加穩定，因此當測量精確度要求不高的時候，也可采用高錳酸鉀氧化比色法測定水溶性有機碳。并且從表2可以看出，高錳酸鉀氧化比色測定的回收率都高于80%，同種濃度的草酸和水楊酸相比，水楊酸的回收率都高于草酸。

表2 不同濃度的草酸和水楊酸高錳酸鉀氧化比色測定與TOC儀器法測定結果比較

3.3 WSOC高錳酸鉀氧化比色法測定與TOC測定結果的比較

以貴州普定縣陳家寨喀斯特小流域為研究區域，在耕地、果園、荒草地、灌木林地和人工林這5種土地利用方式下各取9個土壤樣品，共計45個樣品，稱取5 g(干質量)土樣，加入 2 400 mL 蒸餾水，于常溫下振蕩30 min，4 000 r/min離心 10 min，上清液過0.45 μm的濾膜，浸提液中有機碳采用高錳酸鉀氧化比色法測定。高錳酸鉀氧化比色法測定結果和TOC儀器法測定結果比較見表3。

高錳酸鉀氧化比色法測定45個WSOC含量在0.02～0.4 mg/g 之間，TOC儀器法的測定結果為0.04～0.56 mg/g。2種方法測定的45個土樣水溶性有機碳含量的高低變化基本一致，但TOC儀器法的測定水溶性有機碳含量的平均值高于高錳酸鉀氧化比色法測定的結果，這可能是因為TOC高溫燃燒把水溶性有機碳氧化得更完全。高錳酸鉀氧化比色法的變異系數值為61.53%，高于TOC測定的變異系數值。在配對樣品的t檢驗方面，二者的相關性高達0.941，重復取樣的顯著性P>0.05，說明2種方法測定的結果不存在顯著性差異，具有良好的一致性。應用線性方程擬合高錳酸鉀氧化比色法和TOC法所測的土壤水溶性數據，發現二者線性擬合較好(圖3)。

表3 WSOC高錳酸鉀氧化法與TOC儀器法的測定結果比較

高錳酸鉀氧化比色法測定的WSOC結果偏低，可以通過圖3線性方程的關系進行矯正，即高錳酸鉀氧化比色法測定的WSOC結果乘以1.28等于TOC儀器法的測定結果。

4 討論與結論

借鑒土壤活性有機碳的高錳酸鉀氧化比色法，探索并確定了土壤水溶性有機碳的高錳酸鉀氧化比色法，在測定WSOC值時，波長可選擇490 nm和525 nm，顯色在2 h即可。已知碳濃度的有機化學試劑與高錳酸鉀氧化比色時，相同濃度的水楊酸比草酸的回收率更高，這可能是由于含脂肪鏈的草酸與高錳酸鉀反應沒有水楊酸敏感，但是不同濃度的草酸和水楊酸與高錳酸鉀氧化比色得到的含碳值和其理論的含碳值相差不大，占理論值的80%以上，這也說明氧化的過程中高錳酸鉀濃度變化1 mmol所消耗9 mg碳的假設在水溶性有機碳的測定中也是成立的。但是土壤中水溶性有機碳主要包括脂肪酸、芳香酸、氨基酸、單糖、低聚糖和低分子量的富里酸等，如果不同的土壤組成差異比較大的話，采用該方法就可能存在一定偏差。通過配對樣品的t檢驗得知，高錳酸鉀氧化比色法測定WSOC的值與TOC儀器法的測定結果不具有顯著性差異，說明可以用高錳酸鉀氧化比色法測定WSOC，雖然相對于TOC儀器法的測定結果較低，但是與TOC儀器法的測定結果有著良好的線性關系，乘以矯正系數1.28即為TOC儀器法的測定值。由于不同研究者采用土壤樣品的類型和數量不同、土壤溶液的浸提方法不同，造成轉換方程式也會不同，相應的矯正系數也會出現差別。盡管本研究的研究區域具有一定的代表性，土壤樣品數量也較多，由于仍局限于某個區域不夠系統化，因此需更多區域的土壤樣品來進行檢驗，以不斷修正轉換方程式和參數。