神經氨酸酶抑制劑拉尼米韋抗流感病毒分子動力學模擬研究

潘大波，姜德文，張永豪，吳明凱，龍治峰

（黔東南民族職業技術學院，貴州 凱里 556000）

0 引言

神經氨酸酶抑制劑是抗流感病毒一類重要的藥物。目前神經氨酸酶抑制劑主要有拉尼米韋，拉尼米韋辛酸酯、奧司米韋、帕拉米韋和扎那米韋等。其中拉尼米韋辛酸酯是拉尼米韋的前藥，在體內代謝成拉尼米韋而發揮抗流感活性[1-2]。研究顯示拉尼米韋的抗病毒譜廣，包括N1、N7等[3-4]。為了探討拉尼米韋能否抵抗新型亞型流感病毒H17N10，我們采用分子模擬的方法考察拉尼米韋與各種亞型NA的結合特征來闡釋它抗病毒的分子機制[5]。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

從PDB數據庫中獲得H1N1pdm和H7N9神經氨酸酶蛋白-LAN復合物（蛋白ID：3TI3和4MWU）。H17N10的神經氨酸酶拉尼米韋復合物由H17N10的神經氨酸酶（蛋白ID：4GDI）與H7N9神經氨酸酶蛋白-LAN復合物疊合獲得。晶體中的Ca離子和水分子保留。刪掉不合理的結構。

1.2 分子動力學模擬

分子動力學模擬在Amber軟件中模擬完成。拉尼米韋分子參數用Amber的BCC方法擬合電荷，用GAFF方法獲得其參數。蛋白運用14SB立場。體系加12 ?水盒子和抗離子。分子動力學模擬過程經歷體系最小化、體系加熱、平衡和生產相模擬四部分。每個體系模擬200 ns。

1.3 結合自由能計算與氨基酸殘基能量分解

選取每條軌跡的250個結構運用MM-GBSA的方法計算神經氨酸酶與拉尼米韋之間的結合自由能。溶劑和溶質的介電常數分別為80和4。氨基酸殘基能量分解的參數與結合自由能計算的參數一樣。

2 結果

2.1 分子動力學模擬平衡考察

檢測體系在200 ns模擬過程中配體周圍8 ?以內的氨基酸碳α的RMSD隨時間的變化，在整過模擬過程中，體系的RMSD趨于平衡確在1-1.5 ?之間波動，說明在整過模擬過程中，體系處于平衡的過程。然而，N10體系的波動比N1和N9的大，這可能是N10與拉尼米韋的結合不是特別穩定導致的。

2.2 拉尼米韋與神經氨酸酶的結合親和力

運用MM-GBSA計算拉尼米韋與各種亞型神經氨酸酶的結合自由能如表1所示。拉尼米韋與H1N1pdm和H7N9的結合自由能（ΔGbind）分別為-36.96 kcal/mol和-33.07 kcal/mol，而拉尼米韋與H17N10的結合自由能為-18.48 kcal/mol。其中極性相互作用（ΔGpolar）和非極性相互作用（ΔGnonpolar）都是負值，均有利于拉尼米韋與神經氨酸酶的結合。

表1 拉尼米韋與神經氨酸酶的結合自由能（kcal/mol）

2.3 神經氨酸酶氨基酸對拉尼米韋的能量貢獻

為了弄清H1N1pdm-LAN和H17N10與拉尼米韋的結合差異，運用MM-GBSA計算神經氨酸酶的氨基酸殘基對拉尼米韋的能量貢獻（圖1）顯示，在H1N1pdm-LAN體系中，對拉尼米韋的結合能量貢獻大于1 kcal/mol的氨基酸為Arg292、Glu227、Glu119、Tyr406、Arg371、Arg152、Trp178、Asp151和Arg224。將H17N10的氨基酸能量貢獻值減去H1N1pdm-LAN發現H17N10的氨基酸存在大于1 kcal/mol的氨基酸7個，這些氨基酸不利于H17N10與拉尼米韋的結合。

圖1 （A）H1N1pdm-LAN體系NA中氨基酸殘基能量貢獻值

圖1 （B）H17N10與H1N1pdm的氨基酸殘基能量貢獻值之差

3 討論

由拉尼米韋與 H1N1pdm和H7N9和的結合自由能顯示，拉尼米韋在抗H1N1pdm和H7N9的作用較好，這在前期很多的實驗中得到驗證。然而，對于新出現的H17N10，計算拉尼米韋與H17N10的神經氨酸酶的結合自由能比拉尼米韋與H1N1pdm或H7N9的結合親和力弱約15 kcal/mol，這表明拉尼米韋抗H17N10的能力較弱[6-8]。

為什么會出現這樣的情況，通過H1N1pdm和H17N10的神經氨酸酶序列比對發現，拉尼米韋與H1N1pdm結合的關鍵氨基酸在H17N10的序列不同，氨基酸性質各異導致與拉尼米韋的親和力不一樣，例如119為氨基酸，在H1N1pdm為Gln，能量貢獻值為-2.24 kcal/mol，在H17N10為Arg，能量貢獻值僅為-0.06 kcal/mol，氨基酸151位、152位、292位、371位和406位等均存在類似的不利于拉尼米韋與H17N10的神經氨酸酶結合的情況[9-10]。

通過運用分子動力學模擬的方法考察拉尼米韋與不同神經氨酸酶亞型的結合親和力可以快速判斷拉尼米韋對不同的神經氨酸酶亞型具有活性。同時通過能量分解可以闡釋拉尼米韋與神經氨酸酶結合的詳細作用機制。